जिआर्डिया ड्युओडेनम हा एक परजीवी जीव आहे ज्यामुळे giardiasis होतो, एक आतड्यांसंबंधी संसर्ग विशेषतः लहान मुलांमध्ये अतिसाराची क्लिनिकल चिन्हे असतात.आम्ही यापूर्वी नोंदवले आहे की एक्स्ट्रासेल्युलर G. ड्युओडेनालिस इंट्रासेल्युलर ऑलिगोमेरायझेशन-सदृश रिसेप्टर 3 (NLRP3) बंधनकारक न्यूक्लियोटाइड्सच्या सक्रियतेला चालना देते आणि बाह्य पेशी (EV) स्रावाद्वारे होस्ट दाहक प्रतिक्रियांचे नियमन करते.तथापि, या प्रक्रियेत सामील असलेल्या रोगजनक-संबंधित ड्युओडेनोकोकल EV (GEV) चे अचूक आण्विक नमुने आणि giardiasis मध्ये NLRP3 दाहक ची भूमिका स्पष्ट करणे बाकी आहे.
GEV मधील रिकॉम्बिनंट युकेरियोटिक एक्स्प्रेशन प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि alpha-7.3 giardins बांधण्यात आले, माऊसच्या प्राथमिक पेरीटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये रूपांतरित केले गेले आणि दाह लक्ष्य रेणू कॅस्पेस-1 मोजून शोधले गेले.p20 अभिव्यक्ती पातळी तपासली गेली..G. duodenalis alpha-2 आणि alpha-7.3 giardines मूळतः NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 and caspase-1 p20), IL स्राव मोजून ओळखले गेले.1β पातळी, अपोप्टोटिक स्पॉटेड प्रोटीन (एएससी) ऑलिगोमेरायझेशन पातळी आणि एनएलआरपी3 आणि एएससीचे इम्युनोफ्लोरोसेंट लोकॅलायझेशन.G. duodenalis च्या रोगजनकतेमध्ये NLRP3 दाहकतेच्या भूमिकेचे नंतर उंदीर वापरून मूल्यांकन केले गेले ज्यामध्ये NLRP3 सक्रियकरण अवरोधित केले गेले (NLRP3 अवरोधित उंदीर) आणि शरीराच्या वजनातील पॅथॉलॉजिकल बदल, पक्वाशयातील परजीवी लोड आणि पक्वाशयाच्या ऊतींचे निरीक्षण केले गेले.या व्यतिरिक्त, आम्ही तपासले की hiardines alpha-2 आणि alpha-7.3 विवोमध्ये IL-1β स्राव NLRP3 इन्फ्लॅमासोमद्वारे प्रवृत्त करतात आणि उंदरांमध्ये G. ड्युओडेनलिसच्या रोगजनकतेमध्ये या रेणूंची भूमिका निर्धारित केली.
अल्फा-२ आणि अल्फा-७.३ जिआर्डिन इन विट्रोमध्ये एनएलआरपी३ इन्फ्लेमासोम सक्रिय करण्यास प्रवृत्त करतात.यामुळे p20 कॅस्पेस-1 सक्रिय झाले, NLRP3, प्रो-IL-1β आणि प्रो-कॅस्पेस-1 प्रोटीन्सच्या अभिव्यक्ती पातळीत वाढ झाली, IL-1β स्रावात लक्षणीय वाढ झाली, एएसए स्पॉट्सची निर्मिती झाली. सायटोप्लाझम, आणि एएसए ऑलिगोमेरायझेशनचे प्रेरण.NLRP3 जळजळ पेनाइलचे नुकसान उंदरांमध्ये G. duodenalis ची रोगजनकता वाढवते.NLRP3-अवरोधित उंदरांच्या गॅवेजद्वारे सिस्टवर उपचार केलेल्या उंदरांमध्ये ट्रॉफोझोइट्सची वाढलेली संख्या आणि ड्युओडेनल विलीला गंभीर नुकसान दिसून आले, ज्याचे वैशिष्ट्य संकुचित आणि फांद्या असलेल्या नेक्रोटिक क्रिप्ट्सद्वारे होते.व्हिव्होच्या प्रयोगांमध्ये असे दिसून आले आहे की जिआर्डिन अल्फा-२ आणि अल्फा-७.३ हे एनएलआरपी३ इन्फ्लेमासोमद्वारे IL-१β चे स्राव निर्माण करू शकतात आणि जिआर्डिन अल्फा-२ आणि अल्फा-७.३ सह लसीकरणाने उंदरांमध्ये G. ड्युओडेनलिसची रोगजनकता कमी केली.
या अभ्यासाचे निष्कर्ष असे सुचवतात की जिआर्डिया अल्फा-२ आणि अल्फा-७.३ यजमान NLRP3 जळजळ कमी करतात आणि उंदरांमध्ये G. duodenalis ची संसर्ग कमी करतात, जे giardiasis रोखण्यासाठी आशादायक लक्ष्य आहेत.
जिआर्डिया ड्युओडेनम हा एक बाह्य कोशिकीय प्रोटोझोअन परजीवी आहे जो लहान आतड्यात राहतो आणि दरवर्षी अतिसारासह 280 दशलक्ष giardiasis च्या घटना घडतात, विशेषत: विकसनशील देशांमधील लहान मुलांमध्ये [1].एम. ड्युओडेनम सिस्टने दूषित पाणी किंवा अन्न पिल्याने लोकांना संसर्ग होतो, जे नंतर पोटात जातात आणि जठरासंबंधी रसांमध्ये उत्सर्जित होतात.जिआर्डिया ड्युओडेनम ट्रोफोझोइट्स पक्वाशयाच्या उपकलाला जोडतात, ज्यामुळे मळमळ, उलट्या, अतिसार, ओटीपोटात दुखणे आणि वजन कमी होते.इम्युनोडेफिशियन्सी आणि सिस्टिक फायब्रोसिस असलेल्या व्यक्तींना संसर्ग होण्याची शक्यता असते.तोंडावाटे आणि गुदद्वारासंबंधीचा संभोग [२] द्वारे देखील संसर्ग होऊ शकतो.मेट्रोनिडाझोल, टिनिडाझोल आणि निटाझोक्सानाइड यांसारखी औषधे पक्वाशयाच्या संसर्गासाठी पसंतीचे उपचार पर्याय आहेत [३].तथापि, या केमोथेरपी औषधांमुळे मळमळ, कार्सिनोजेनेसिस आणि जीनोटॉक्सिसिटी [४] सारखे प्रतिकूल दुष्परिणाम होतात.म्हणून, G. duodenalis संसर्ग टाळण्यासाठी अधिक प्रभावी धोरणे विकसित करणे आवश्यक आहे.
इन्फ्लामासोम्स हा सायटोसोलिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्सचा एक वर्ग आहे जो जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रतिसादाचा भाग आहे, रोगजनकांच्या आक्रमणापासून बचाव करण्यास आणि दाहक प्रतिक्रियांमध्ये मध्यस्थी करण्यास मदत करते [५].या जळजळांमध्ये, न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेरायझेशन (एनओडी) रिसेप्टर 3 (एनएलआरपी3) न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेरायझेशन (एनएलआरपी3) न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग-सदृश इन्फ्लामासोमचा विस्तृतपणे अभ्यास केला गेला आहे कारण तो विविध रोगजनक/डॅमेज पॅटर्नद्वारे शोधला जाऊ शकतो. DAMP), जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रणाली ओळखते, सक्रिय करते.आणि अनेक दाहक रोगांमध्ये आतड्यांसंबंधी होमिओस्टॅसिस नियंत्रित करते [6,7,8].यामध्ये पॅटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर (PRR) NLRP3, ॲडॉप्टर अपोप्टोटिक स्पॉटेड प्रोटीन (एएससी), आणि इफेक्टर प्रोकास्पेस-1 किंवा प्रोकास्पेस-11 यांचा समावेश आहे.निओस्पोरा कॅनिनम [९], पॅराकोक्सीडियोइड्स ब्रासिलिलेन्सिस [१०] आणि लीशमॅनिया अभ्यासामध्ये आढळल्याप्रमाणे NLRP3 दाहक रोगकारक आक्रमणाविरूद्ध एक यजमान म्हणून कार्य करते.[११], परंतु असेही नोंदवले गेले आहे की एनएलआरपी३ इन्फ्लॅमासोमचे सक्रियकरण संरक्षणात्मक प्रतिरक्षा प्रतिसाद मर्यादित करते आणि रोगाची प्रगती वाढवते, उदाहरणार्थ, वर्म्स [१२] मध्ये.आमच्या मागील निष्कर्षांवर आधारित, आम्ही नोंदवले आहे की एक्स्ट्रासेल्युलर जी. ड्युओडेनालिस एनएलआरपी3 जळजळांचे इंट्रासेल्युलर सक्रियकरण ट्रिगर करते आणि एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईव्ही) स्राव करून होस्ट दाहक प्रतिसाद सुधारते [१३].तथापि, Vivo मधील G. duodenalis संसर्गामध्ये NLRP3 इन्फ्लॅमासोमची भूमिका निश्चित करणे बाकी आहे.
Giardins चे मूळतः G. duodenalis cytoskeleton चे स्ट्रक्चरल घटक म्हणून वर्णन करण्यात आले होते आणि ते लहान आतड्यात ट्रोफोझोइट मोटीलिटी आणि एपिथेलियल सेल जोडण्यात महत्वाची भूमिका बजावतात.पर्यावरणाशी अधिक चांगल्या प्रकारे जुळवून घेण्यासाठी आणि त्यांची रोगजनकता वाढवण्यासाठी, G. duodenalis trophozoites ने 8 फ्लॅगेला, 1 मध्यम शरीर आणि 1 वेंट्रल डिस्क [१४] असलेली एक अद्वितीय सायटोस्केलेटल रचना विकसित केली.जिआर्डिया ड्युओडेनमचे ट्रॉफोझोइट्स त्यांच्या सायटोस्केलेटनचा वापर वरच्या लहान आतड्यात, विशेषत: ड्युओडेनममध्ये प्रवेश करण्यासाठी आणि एन्टरोसाइट्सला जोडण्यासाठी करतात.ते सतत स्थलांतर करतात आणि पेशी चयापचय वापरून उपकला पेशींना जोडतात.म्हणून, त्यांच्या सायटोस्केलेटन आणि विषाणू यांच्यात जवळचा संबंध आहे.Giardia duodenum साठी विशिष्ट Giardines हे सायटोस्केलेटन संरचनेचे घटक आहेत [15] आणि चार वर्गांमध्ये विभागले गेले आहेत: α-, β-, γ-, आणि δ-giardines.α-giardin कुटुंबातील 21 सदस्य आहेत, त्या सर्वांमध्ये फॉस्फोलिपिड्स [१६] बांधण्याची कॅल्शियम-आश्रित क्षमता आहे.ते सायटोस्केलेटनला सेल झिल्लीशी देखील जोडतात.G. duodenalis मुळे अतिसार झालेल्या व्यक्तींमध्ये, α-giardins संसर्गादरम्यान अत्यंत व्यक्त आणि इम्युनोरॅक्टिव्ह असतात [१७].जिआर्डिया अल्फा-१ वर आधारित विषम लस उंदरांमध्ये जिआर्डियासिसपासून संरक्षित आहेत आणि लस विकासासाठी संभाव्य उमेदवार प्रतिजन आहेत [१८].अल्फा-8 जिआर्डिन, प्लाझ्मा झिल्ली आणि फ्लॅगेलामध्ये स्थानिकीकृत, परंतु वेंट्रल डिस्कमध्ये नाही, जी. ड्युओडेनालिस [१९] मधील ट्रोफोझोइट्सची गतिशीलता आणि वाढ दर वाढवते.अल्फा-14 जिआर्डिन फ्लॅगेलावरील मायक्रोट्यूब्यूल संरचनांना जोडते आणि जी. ड्युओडेनालिस [२०] च्या व्यवहार्यतेवर परिणाम करते.अल्फा-11 जिआर्डिन संपूर्ण जीवन चक्रात मुबलक प्रमाणात असते आणि अल्फा-11 जिआर्डिनच्या अतिप्रमाणात जी. ड्युओडेनालिसचेच नुकसान होते [२१].तथापि, अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिन जी. ड्युओडेनलिस संसर्ग आणि त्यांच्या अंतर्निहित यंत्रणेपासून संरक्षणात्मक आहेत की नाही हे स्पष्ट नाही.
या अभ्यासात, यजमान NLRP3 सक्रिय करण्यासाठी पुन: संयोजक युकेरियोटिक अभिव्यक्ती प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ला माऊसच्या प्राथमिक पेरीटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये रूपांतरित केले गेले.नंतर दाहक लक्ष्यांची तपासणी केली गेली.आम्ही G. duodenalis च्या रोगजनकतेमध्ये NLRP3 दाहकतेच्या भूमिकेचे देखील मूल्यांकन केले, अल्फा-2 आणि अल्फा-7,3 giardines व्हिव्होमध्ये NLRP3 इन्फ्लॅमासोम सक्रिय करतात की नाही हे तपासले आणि निर्धारित केले की रोगजनकतेमध्ये giardines च्या या दोन भूमिका आहेत. जी. ड्युओडेनालिस.आमचे सामान्य ध्येय G. duodenalis संसर्ग रोखण्यासाठी आशादायक लक्ष्ये विकसित करणे हे होते.
जंगली प्रकार (WT) C57BL/6 5-8 आठवडे वयोगटातील मादी उंदीर Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China) येथून खरेदी करण्यात आले.उंदरांना पाण्यात मोफत प्रवेश होता, त्यांना निर्जंतुकीकरण केलेले अन्न मिळाले आणि त्यांना 12/12 तासांच्या प्रकाश/अंधाराच्या चक्रात ठेवण्यात आले.संसर्गापूर्वी, उंदरांना पिण्याच्या पाण्यात अँपिसिलिन (1 mg/mL), व्हॅनकोमायसिन (1 mg/mL), आणि neomycin (1.4 mg/mL) (सर्व शांघाय, चीन, कृत्रिम जीवांकडून विकत घेतलेल्या) सोबत प्रतिजैविक ॲड लिबिटम मिळाले. ].].24 तासांपेक्षा जास्त काळ खाण्याची आणि पिण्याची क्षमता गमावलेल्या आणि ≥ 20% शरीराचे वजन कमी करणाऱ्या उंदरांना गर्भाशयाच्या ग्रीवेच्या विघटनाने मानवतेने euthanized करण्यात आले.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) 12.5% ​​भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS; प्रत्येक ग्रीन, झेजियांग, चीन) आणि 0.1% बोवाइन पित्त (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट मिसूरी, यूएस) सह पूरक होते. ).यूएसए) मायक्रोएरोबिक परिस्थितीत.संमिश्र ट्रॉफोझोइट्स बर्फावर गोळा केले गेले आणि पुढील पुनरुत्पादनासाठी 1:4 च्या प्रमाणात पास केले गेले.
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे जिआर्डिया ड्युओडेनम सिस्ट प्रेरित केले गेले [२३], ट्रॉफोझोइट्स लॉगरिदमिक टप्प्यात कापले गेले आणि नंतर एन्कॅप्सुलेशन इंड्युसिंग माध्यम, pH 7.1 (सुधारित TYI-S-33) सह 1 × 106 ट्रॉफोझोइट्सच्या अंतिम एकाग्रतेमध्ये पातळ केले गेले.पित्त एकाग्रता 0.05% मध्यम).लॉगरिदमिक वाढीच्या टप्प्यापर्यंत ट्रॉफोझोइट्सचे संवर्धन अनएरोबिक परिस्थितीत 37°C तापमानात होते.सिस्ट इंड्युसिंग माध्यम (pH 7.8; 1% पित्त एकाग्रतेसह सुधारित TYI-S-33 माध्यम) आणि कल्चर G. ड्युओडेनालिस 37°C वर 48-96 तासांसाठी बदला, ज्या दरम्यान सिस्टची निर्मिती सूक्ष्मदर्शकाखाली दिसून आली.बहुतेक ट्रॉफोझोइट्सना गळू तयार करण्यासाठी प्रेरित केल्यानंतर, कल्चर मिश्रणाची कापणी केली गेली आणि उर्वरित ट्रॉफोझोइट्स लाइझ करण्यासाठी निर्जंतुक डीआयोनाइज्ड पाण्यात पुन्हा टाकण्यात आली.उंदरांमधील गॅस्ट्रिक ट्यूबद्वारे त्यानंतरच्या विश्लेषणासाठी सिस्टची मोजणी केली गेली आणि 4°C वर साठवली गेली.
जिआर्डिया एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (जीईव्ही) पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे समृद्ध केले गेले [१३].लॉगरिदमिक वाढीच्या टप्प्यातील ट्रॉफोझोइट्स एक्सोसोम-कमी झालेल्या FBS (जैविक उद्योग, बीट-हेमेक, इस्त्राईल) सह तयार केलेल्या सुधारित TYI-S-33 माध्यमात 1 × 106 परजीवी/mL च्या अंतिम एकाग्रतेपर्यंत पुन्हा निलंबित केले गेले आणि 12 तास उबवले गेले.10 मिनिटांसाठी 2000 ग्रॅम, 45 मिनिटांसाठी 10,000 ग्रॅम आणि 60 मिनिटांसाठी 100,000 ग्रॅम सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे कल्चर सुपरनॅटंटपासून वेगळे केले गेले.फॉस्फेट बफर सलाईन (PBS) मध्ये अवक्षेपण विसर्जित केले गेले, बीसीए प्रोटीन परख किट (थर्मो फिशर सायंटिफिक, वॉल्थम, एमए, यूएसए) वापरून परिमाण केले गेले आणि -80 डिग्री सेल्सिअस तापमानात साठवले गेले किंवा पुढील विश्लेषणासाठी थेट वापरले गेले.
प्राथमिक माऊस पेरिटोनियल मॅक्रोफेज पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केले गेले होते [२४].थोडक्यात, उंदरांना (6-8 आठवडे वयोगटातील) 2.5 मिली 2.98% डिफ्को लिक्विड थायोग्लायकॉल मिडीयम (बीडी, फ्रँकलिन लेक्स, एनजे, यूएसए) इंजेक्शन (इंट्रापेरिटोनली [आयपी]) आणि 3-4 टाळू दिले गेले.इच्छामरणानंतर उंदरांच्या उदरपोकळीतून मॅक्रोफेजचे निलंबन गोळा केले गेले आणि 10 मिनिटांसाठी 1000 ग्रॅमवर ​​3 वेळा सेंट्रीफ्यूज केले गेले.सेल शुद्धता 98% पर्यंत CD11b मार्कर वापरून फ्लो सायटोमेट्रीद्वारे कापणी केलेल्या पेशी शोधल्या गेल्या, नंतर 6-वेल सेल कल्चर प्लेट्समध्ये (4.5 x 106 सेल/वेल) जोडल्या गेल्या आणि 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 10% FBS (बायोइंडस्ट्री) ने उष्मायन केले.आणि 5% CO2.
TRIzol अभिकर्मक (Vazyme, Nanjing, China) च्या 1 मिली मध्ये 1 × 107 ट्रॉफोझोइट्समधून RNA काढण्यात आला, मोनस्क्रिप्ट dsDNase (मोनाड, वुहान, चीन) वापरून एकूण G. duodenalis RNA मधून जीनोमिक DNA काढण्यात आला आणि पूरक DNA (Conjing, China) मधून काढला गेला. निर्मात्याच्या सूचनांनुसार MonScript RTIIII सुपर मिक्स (मोनाड) वापरणे.
लक्ष्य G. duodenalis जनुकासाठी CDS अनुक्रम माहिती NCBI GenBank कडून प्राप्त झाली.प्रत्येक लक्ष्य जनुकासाठी विशिष्ट सीमलेस क्लोनिंग प्राइमर्स डिझाइन करण्यासाठी प्राइमर 5.0 वापरा.फॉरवर्ड प्राइमर (5′-3′) मध्ये तीन भाग असतात: रेखीय वेक्टर pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) सह ओव्हरलॅपिंग अनुक्रम आणि ATG आणि GNN कोडन सुरू करा (जर पहिला बेस G नसेल).अभिव्यक्तीची कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी हे केले जाते.याव्यतिरिक्त, किमान 16 bp एकत्रित बेस (GC सामग्री 40-60%/Tm अंदाजे. 55 °C).रिव्हर्स प्राइमर (5′-3′) मध्ये दोन भाग असतात, EcoRV-लाइनराइज्ड वेक्टर pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) सह ओव्हरलॅपिंग सीक्वेन्स आणि किमान 16 bp चा एकत्रित बेस.(शेवटचे दोन थांबे वगळून).बेस) कोडॉन जसे की AA किंवा GA रीकॉम्बीनंट प्लाझमिड्सना त्यांचे लेबल केलेले प्रथिने व्यक्त करण्यास अनुमती देण्यासाठी).प्राइमर अनुक्रम तक्ता 1 मध्ये सूचीबद्ध आहेत आणि कांगमेट बायोटेक्नॉलॉजी कंपनी लिमिटेड (चांगचुन, चीन) द्वारे संश्लेषित केले गेले आहेत.
Pfu DNA पॉलिमरेझ (Tiangen, Beijing, China) किंवा Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., बीजिंग, चीन) चा वापर करून तयार केलेल्या G. duodenalis cDNA चा टेम्पलेट म्हणून लक्ष्य वाढवण्यात आले.युकेरियोटिक अभिव्यक्ती व्हेक्टर प्लाझमिड pcDNA3.1(+) हे निर्बंध एंझाइम EcoRV सह रेखीय केले गेले आणि फास्ट एपी (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून डिफॉस्फोरिलेट केले गेले.रेखीयकृत pcDNA3.1(+) तुकडे आणि वाढवलेले लक्ष्य जनुकाचे तुकडे डीएनए जेल शुद्धीकरण किट (टियांजेन) वापरून शुद्ध केले गेले आणि नॅनोड्रॉप ND-2000 (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून परिमाण निश्चित केले गेले.pcDNA3.1(+) तुकडा आणि प्रत्येक लक्ष्य जनुकाचा तुकडा MonClone सिंगल असेंब्ली क्लोनिंग मिक्स (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) वापरून पुन्हा एकत्र केला गेला आणि Comate Bioscience Company Limited (चांगचुन, चीन) वापरून DNA अनुक्रमाने पुष्टी केली..
एन्डोटॉक्सिन-फ्री प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 सॅनप्रेप एंडोटॉक्सिन-फ्री प्लाझमिड मिनी किट (सांगॉन बायोटेक) वापरून तयार केले गेले.इल्यूशन बफरमधील EDTA ने ट्रान्सफेक्शन परखमध्ये व्यत्यय आणला नाही याची खात्री करण्यासाठी 500 ng/µl वर एकाग्रता राखली गेली.प्राथमिक माऊस पेरिटोनियल मॅक्रोफेज 6-वेल प्लेट्समध्ये 12 तासांसाठी पूर्ण RPMI 1640 माध्यम (जैविक उद्योग) मध्ये संवर्धन केले गेले, नंतर पेनिसिलिन आणि स्ट्रेप्टोमायसिन काढून टाकण्यासाठी कोमट पीबीएसमध्ये पेशी 3 वेळा धुतल्या गेल्या आणि नंतर पूर्ण माध्यमाने पूरक केले गेले.एंडोटॉक्सिन-मुक्त प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) ऑप्टी-एमईएम कमी केलेल्या सीरम माध्यमाच्या 125 μl मध्ये पातळ केले गेले (Gibco, थर्मो फिशर सायंटिफिक)..नंतर Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) चे 5 μl कमी सीरम Opti-MEM माध्यमाच्या 125 μl मध्ये पातळ केले गेले.लिपोसोम-डीएनए कॉम्प्लेक्स तयार करा लिपोफेक्टामाइन 2000 मध्ये पातळ केलेले एंडोटॉक्सिन-मुक्त प्लाझमिड मिसळून आणि मिश्रण खोलीच्या तपमानावर 5 मिनिटे उभे राहू द्या.प्रत्येक विहिरीतील पेशींमध्ये कॉम्प्लेक्स स्वतंत्रपणे हस्तांतरित करा आणि हळूहळू मिसळा.4 तासांनंतर, सेल कल्चर माध्यम 2 मिली पूर्ण RPMI 1640 माध्यमाने बदलले गेले आणि कल्चर 24 तास चालू ठेवले गेले.पेशींमध्ये ताजे सेल कल्चर माध्यम जोडले गेले आणि परख डिझाइनवर अवलंबून विविध वेळ बिंदूंसाठी उष्मायन केले गेले.
सुपरनॅटंट्स आणि सेल लाइसेट्समधील प्रथिने नमुने पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केले गेले होते [२५].pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, आणि His-tag साठी झिल्ली हस्तांतरण मापदंड 200 mA/90 मिनिट होते.इंटरल्यूकिन 1β (IL-1β; R&D सिस्टीम्स, मिनियापोलिस, मिनेसोटा, यूएसए), कॅस्पेस-1 (p20) (एडिपोजेन, स्वित्झर्लंड) आणि NLRP3 (एडिपोजेन SA, एपलिंगेस, स्वित्झर्लंड) आणि 1:5000 लक्ष्यित त्याच्या टॅगसाठी ( Amylet Scientific), वुहान, चीन) आणि β-actin (प्रोटीनटेक, वुहान, चीन).
पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे डिस्किनिमाइड सबरेट (डीएसएस) सह क्रॉस-लिंकिंग केले गेले [26].25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES आणि 125 mM NaHCO3 असलेल्या 50 μl ASC प्रतिक्रिया बफर (pH 8.0) मध्ये 3 वेळा कोल्ड PBS ने कोशिका धुतल्या गेल्या आणि 27 गेज सुईने पूर्णपणे लाइज केल्या गेल्या.मिश्रण 3 मिनिटांसाठी 5000 ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि गोळ्याला 10 μl DSS (DMSO मध्ये 25 mM) आणि 40 μl ASC प्रतिक्रिया बफरने 30 मिनिटांसाठी 37°C तापमानात बांधले गेले.10 मिनिटांसाठी 5000 ग्रॅमवर ​​सेंट्रीफ्यूगेशन केल्यानंतर, गोळी ASC प्रतिक्रिया बफरच्या 40 µl आणि 6x प्रोटीन लोडिंग बफरच्या 10 µl (ट्रान्सजेन, बीजिंग, चीन) च्या द्रावणात विरघळली गेली आणि नंतर खोलीच्या तपमानावर 15 पर्यंत द्रावण शांत केले गेले. मि, नंतर 10 मिनिटे उकळवा.प्रथिनांचे नमुने नंतर 1:500 च्या सौम्य प्रमाणात प्राथमिक अँटी-एएससी अँटीबॉडीज (वॅनलेबियो, शेनयांग, चीन) वापरून वेस्टर्न ब्लॉटिंगच्या अधीन होते.
पूर्वी वर्णन केलेल्या प्रक्रियेनंतर [१३], सेल कल्चर सुपरनॅटंट्सची कापणी केली गेली आणि माऊस IL-1 बीटा एलिसा किट (इनव्हिट्रोजन, थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकाइन IL-1β चे स्राव निश्चित केले गेले.IL-1β मानक वक्र वापरून OD450nm मूल्यांना प्रथिने एकाग्रतेमध्ये रूपांतरित करा.
कव्हरस्लिप्सवर लेपित पेशी 3 वेळा उबदार पीबीएसमध्ये धुतल्या जातात, टिश्यू सेल फिक्सेटिव्ह (बायोशार्प, बीजिंग, चीन) मध्ये 10 मिनिटे खोलीच्या तापमानात (आरटी), 0.1% ट्रायटन एक्स-पर्मेबिलाइझ 100 मध्ये (पीबीएसमध्ये पातळ केल्या जातात; बायोशार्प) ) 20 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर आणि 5% बोवाइन सीरम अल्ब्युमिनमध्ये (पीबीएसमध्ये) खोलीच्या तपमानावर 2 तास ब्लॉक करा.त्यानंतर पेशींना अनुक्रमे ASC (1:100 dilution) किंवा NLRP3 (1:100 dilution) विरुद्ध प्राथमिक अँटीबॉडीजसह 4°C वर रात्रभर उष्मायन केले गेले आणि Cy3 हे शेळी-विरोधी IgG(H+L) (1:400; EarthOx) असे लेबल लावले. , सॅन फ्रान्सिस्को, CA, USA) किंवा FITC-संयुग्मित शेळी अँटी-माउस IgG (1:400; अर्थॉक्स) रात्रभर 37°C वर 1 तास अंधारात.केंद्रक Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) ने 5 मिनिटांसाठी डागले होते आणि फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोप (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) अंतर्गत निरीक्षण केले होते.
उंदरांची चार गटांमध्ये विभागणी करण्यात आली होती (प्रत्येक गटात n = 7): (i) PBS-उपचारित नकारात्मक नियंत्रण गट (फक्त PBS; गॅव्हेज 100 μl/माउस PBS त्यानंतर दररोज इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन 100 μl/ माउस PBS 3 तासांनंतर)., सतत 7 दिवस);(ii) MCC950 इनहिबिटर [27] (PBS gavage द्वारे 100 μl/माऊस, 3 तासांनंतर, 10 mg/kg शरीराचे वजन [BW] MCC950 [PBS मध्ये] दररोज इंट्रापेरिटोनली प्रशासित केले गेले, कालावधी 7 दिवस) नकारात्मक नियंत्रण गटाने उपचार केला;(iii) G. duodenalis सिस्ट संसर्ग गट (1.5 x 106 cysts/mouse by gavage, 3 तासांनंतर, 100 μl/माउस PBS इंट्रापेरिटोनली 7 दिवसांसाठी दररोज प्रशासित);(iv) G. ड्युओडेनालिस सिस्ट एकत्रित संक्रमण गट MCC950 इनहिबिटर उपचार गट (1.5×106 सिस्ट/माऊस वाया गॅव्हेज, 10mg/kg शरीराचे वजन MCC950 इंट्रापेरिटोनली दररोज 7 दिवस 3h वाजता).प्रत्येक उंदराच्या शरीराचे वजन दररोज निरीक्षण केले गेले आणि सर्व उंदरांचे 7 व्या दिवशी euthanized करण्यात आले.कापणी केलेला ड्युओडेनम (3 सें.मी. लांब) 1 मिली पीबीएसमध्ये लहान तुकड्यांमध्ये कापला गेला, 4 डिग्री सेल्सिअस तापमानात पीबीएसमध्ये रात्रभर सिस्ट नष्ट केले गेले आणि जी. ड्युओडेनालिस ट्रॉफोझोइट्स.ताजे ड्युओडेनम (1 सेमी लांब) हेमॅटॉक्सीलिन आणि इओसिन (H&E) स्टेनिंगसाठी वेगळे केले गेले.
उंदीर दोन गटांमध्ये विभागले गेले: (i) MOCK नियंत्रण गट आणि (ii) MCC950 अवरोधक गट.प्रत्येक गटामध्ये पाच उपचार होते (n = 7/उपचार गट): (i) PBS उपचार नकारात्मक नियंत्रण गट (केवळ PBS; 100 μl/माऊस PBS, इंट्रामस्क्युलर (IM) इंजेक्शन (टिबिअलिस अँटीरियर) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) प्लाझमिड निगेटिव्ह कंट्रोल ग्रुप (100 µg/माउस डीएनए, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शनद्वारे); (iii) G. ड्युओडेनालिस सिस्ट इन्फेक्शन पॉझिटिव्ह कंट्रोल ग्रुप (1.5 x 106 सिस्ट/माऊस, गॅवेजद्वारे) (iv) a प्लाझमिड pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/माऊस DNA, इंट्रामस्क्यूलर इंजेक्शनद्वारे) आणि (v) प्लाझमिड pcDNA3.1(+)-अल्फा-7.3 (100 μg/माऊस) ने उपचार केलेला गट DNA, 12 तासांनंतर, MCC950 अवरोधक गटातील उंदरांना 7 दिवसांसाठी MCC950 (10 mg/kg शरीराचे वजन) चे दररोज इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन मिळाले, तर MOCK गटातील उंदरांना समान प्रमाणात PBS उपचार मिळाले. रक्ताचे नमुने घेण्यात आले. नेत्रगोलक उंदरांकडून गोळा केले आणि 4 °C वर रात्रभर सोडले गेले.
पस्तीस उंदरांची पाच गटांमध्ये (n=7/गट) विभागणी करण्यात आली.गट 1 हा PBS सह उपचार केलेला नकारात्मक नियंत्रण गट होता: उंदरांना 100 μl PBS इंट्रामस्क्युलरली आणि 3 दिवसांनी गॅवेजद्वारे प्राप्त झाले.ग्रुप 2 हा G. ड्युओडेनालिस सिस्ट्सचा संसर्ग झालेला सकारात्मक नियंत्रण गट आहे: उंदरांना 100 μl PBS चे इंजेक्शन देण्यात आले आणि 3 दिवसांनंतर 1.5 x 106 सिस्ट/माऊस इंट्रागॅस्ट्रिक पद्धतीने इंजेक्ट केले गेले.तिसरा गट - पक्वाशयातील गळू संसर्गासाठी नियंत्रण गटासह pcDNA3.1(+) सह प्लाझ्मिड लसीकरण: उंदरांना 100 μg प्लास्मिड DNA pcDNA3.1(+)(im) तोंडी, 1.5×106 सिस्ट/माऊस 3 अनेकांसाठी दिवसगट 4 आणि 5 हे जी. ड्युओडेनलिस सिस्ट इन्फेक्शनच्या संयोगाने पीसीडीएनए ३.१(+)-अल्फा-२ जिआर्डिन प्लाझमिड किंवा पीसीडीएनए३.१(+)-अल्फा-७.३ जिआर्डिन प्लाझमिड होते.प्रायोगिक गट: उंदरांना 100 µg pcDNA3 मिळाले.1(+)-गिअर्डिन प्लाझमिड डीएनए (im), नंतर 3 दिवसांनंतर, 1.5 × 106 सिस्ट/माऊस गॅव्हेजद्वारे इंजेक्ट केले गेले.नळीद्वारे जी. ड्युओडेनलिस सिस्टचा परिचय दिल्यानंतर प्रत्येक उंदराच्या शरीराचे वजन तपासले गेले.ताजे ड्युओडेनम परजीवी लोड मापन आणि एचई स्टेनिंग विश्लेषणासाठी गोळा केले गेले.
पूर्वी प्रकाशित केलेल्या प्रक्रियेनुसार हिस्टोपॅथॉलॉजिकल बदलांचे विश्लेषण केले गेले [30].ताजे ड्युओडेनम टिश्यू सेल फिक्सेटिव्हसह निश्चित केले गेले, पॅराफिनमध्ये एम्बेड केले गेले, 4 μm विभागात कापले गेले, H&E सह डाग केले गेले आणि हलक्या सूक्ष्मदर्शकाखाली विश्लेषण केले गेले.सात स्वतंत्र उंदरांच्या सात टिश्यू विभागातील प्रातिनिधिक पॅथॉलॉजिकल बदलांचे मूल्यांकन पॅथॉलॉजिस्टने केले ज्याला उपचाराविषयी माहिती नव्हती आणि 200x वाढीवर पकडले गेले.विलीची लांबी आणि क्रिप्ट्सची खोली पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धतींनुसार मोजली गेली.
विट्रो आणि व्हिव्होमधील परिणाम त्रिगुणांमध्ये प्राप्त झाले.ग्राफपॅड प्रिझम 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) वापरून आलेख तयार केले गेले.दोन गटांमधील फरकांचे विश्लेषण t-चाचणीद्वारे केले गेले, तर ≥3 गटांमधील फरकांचे विश्लेषण SPSS सॉफ्टवेअर (आवृत्ती 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) वापरून एकमार्गी विश्लेषण (ANOVA) द्वारे केले गेले.लेवेनची चाचणी वापरून भिन्नतेच्या एकसंधतेसाठी डेटाचे विश्लेषण केले गेले आणि त्यानंतर बोनफेरोनीची पोस्ट हॉक चाचणी (बी) आली.महत्त्व P<0.05, P<0.01, आणि P<0.001 (महत्त्वपूर्ण नाही [ns]) (P>0.05) म्हणून व्यक्त केले जाते.
क्योटो एन्सायक्लोपीडिया ऑफ जीन्स अँड जीनोम्स (केईजीजी) मधील जीईव्ही प्रोटिओमिक्सच्या आमच्या मागील विश्लेषणात असे दिसून आले आहे की दाहक सिग्नलिंग मार्गांच्या सक्रियतेमध्ये अनेक लक्ष्ये गुंतलेली असू शकतात [१३].आम्ही दोन आशादायक लक्ष्ये निवडली, अल्फा-2 आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिन, हे रेणू वाढवतात आणि pcDNA3.1(+) युकेरियोटिक अभिव्यक्ती वेक्टर तयार करण्यासाठी त्यांचा वापर करतात.अनुक्रमानंतर, रीकॉम्बीनंट pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि alpha-7.3 giardine expression plasmids प्राथमिक माउस पेरिटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये बदलले गेले आणि कॅस्पेस-1 p20 सिग्नेचर प्रथिने जळजळ (सक्रिय कॅस्पेस-1 चा एक तुकडा) ओळखला गेला. जळजळ ट्रिगर करू शकणारे मुख्य रेणू स्पष्टीकरण म्हणून.परिणामांनी दर्शविले की अल्फा-2 आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिन जीईव्ही प्रमाणेच p20 कॅस्पेस-1 अभिव्यक्ती प्रेरित करू शकतात.उपचार न केलेले नकारात्मक नियंत्रण (केवळ पीबीएस) आणि प्लाझमिड नियंत्रण pcDNA3.1(+) (आकृती 1) मध्ये कॅस्पेस-1 सक्रियकरणावर कोणताही प्रभाव आढळला नाही.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि alpha-7.3 giardins द्वारे p20 caspase-1 सक्रियतेचे मापन.रिकॉम्बिनंट युकेरियोटिक एक्सप्रेशन प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि alpha-7.3 giardines (प्रत्येक लेनच्या वर) प्राथमिक माऊस पेरिटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये बदलले गेले आणि कल्चर सुपरनॅटंट्स 24 तासांनंतर कापले गेले.वेस्टर्न ब्लॉटिंगचा वापर सिग्नेचर कॅस्पेस-1 p20 इन्फ्लेमासोम प्रोटीनच्या अभिव्यक्ती पातळी मोजण्यासाठी केला गेला.PBS-केवळ उपचार गट (लेन C) आणि pcDNA3.1(+) मोनोथेरपी गट (pcDNA3.1 लेन) नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले गेले आणि GEV उपचार गट सकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले गेले.प्रत्येक प्रोटीनमध्ये हिस्टिडाइन टॅग शोधून रिकॉम्बिनंट प्रोटीनच्या अभिव्यक्तीची पुष्टी केली गेली आणि अपेक्षित प्रोटीन बँड अल्फा-2 जिआर्डिन (38.2 केडीए) आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिन (37.2 केडीए) होते.GEV, Giardia duodenum extracellular vesicles, pcDNA3.1(+), EcoRV-रेखीय वेक्टर, SUP, supernatant
alpha-2 giardine आणि alpha-7.3 giardine p20 caspase-1 अभिव्यक्ती प्रेरित करतात की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी आणि होस्ट NLRP3 दाहक प्रतिसाद, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine आणि pcDNA3.1(+)-अल्फा सक्रिय करण्यात भूमिका बजावतात. -7.3 जिआर्डिनला रीकॉम्बीनंट प्लाझमिड डीएनए सह प्राथमिक माउस पेरीटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये रूपांतरित केले गेले आणि मुख्य दाहक प्रथिने NLRP3 चे अभिव्यक्ती, स्थानिकीकरण आणि ऑलिगोमेरायझेशनचे स्तर निर्धारित केले गेले.या प्रयोगात, GEV चा उपयोग सकारात्मक नियंत्रण गट म्हणून केला गेला आणि कोणताही उपचार गट (केवळ PBS) किंवा pcDNA3.1(+) संक्रमण उपचार गट नकारात्मक गट होता.परिणामांवरून असे दिसून आले की, GEV गटाप्रमाणे, giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 आणि giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 च्या रीकॉम्बिनंट प्लाझमिड डीएनएमुळे NLRP3, प्रो-IL-1β आणि procaspase-1 आणि caspase-1 सक्रियकरण (Fig. 2a).याव्यतिरिक्त, दोन्ही जिआर्डिनने लक्षणीय IL-1β स्राव (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.007. ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (आकृती 2b).बहुतेक ASC प्रथिने नो-ट्रीटमेंट ग्रुपमध्ये किंवा pcDNA3.1(+) प्लाझमिडने ट्रान्सफेक्ट केलेल्या उपचार गटातील मोनोमेरिक होती, pcDNA3.1(+)-alpha-2 किंवा pcDNA3.1(+)-अल्फा- 7.3 giardine.ASC ऑलिगोमेरायझेशन GEV पॉझिटिव्ह कंट्रोल ग्रुप किंवा ग्रुपच्या रीकॉम्बीनंट प्लाझमिड डीएनएमध्ये झाले, एक ऑलिगोमेरिक फॉर्म (आकृती 2c) दर्शवित आहे.हे प्राथमिक डेटा सूचित करतात की अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा-7,3 जिआर्डिन एनएलआरपी3 जळजळ सक्रिय करण्यास प्रवृत्त करू शकतात.ASC आणि NLRP3 च्या स्थानिकीकरणाच्या त्यानंतरच्या इम्युनोफ्लोरोसेंट अभ्यासातून असे दिसून आले की नकारात्मक नियंत्रण गटामध्ये, ASC प्रथिने संपूर्ण सायटोप्लाझममध्ये विखुरलेले होते आणि pcDNA3.1(+)-alpha-2 च्या उत्तेजनावर giardine किंवा pcDNA3 सह डॉट सिग्नल म्हणून दिसले.1(+)-अल्फा-7,3 giardine गट किंवा GEV सकारात्मक नियंत्रण गट (आकृती 2d).नकारात्मक नियंत्रण आणि प्लाझमिड-उपचारित pcDNA 3.1 गटांमध्ये, NLRP3 प्रोटीन सिग्नल आढळला नाही, तर pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine किंवा pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 च्या प्रतिसादात फ्लोरोसेंट सिग्नल डॉट आढळला. आढळून आले..जिआर्डिन हे सायटोप्लाझममध्ये किंवा HEV (Fig. 2e) उत्तेजित झाल्यावर आढळतात.हे डेटा पुढे दाखवतात की G. duodenalis giardin alpha-2 आणि giardin alpha-7.3 माऊसच्या प्राथमिक पेरीटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये NLRP3 दाहक क्रिया सक्रिय करतात.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin माऊस पेरिटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये NLRP3 दाहक क्रिया सक्रिय करतात.रिकॉम्बिनंट युकेरियोटिक एक्सप्रेशन प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin प्राथमिक म्युरिन पेरिटोनियल मॅक्रोफेजेस आणि पेशींमध्ये स्थानांतरित करा किंवा अभिव्यक्तीच्या विश्लेषणासाठी 24 तासांच्या आत सुपरनॅटंटची कापणी करा, ऑलिगोमरायझेशन , स्राव.आणि मुख्य दाहक प्रथिनांचे स्थानिकीकरण.केवळ PBS (C) गट आणि pcDNA3.1(+) एकल उपचार गट नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले गेले आणि GEV उपचार गट सकारात्मक गट म्हणून वापरले गेले.NLRP3, प्रो-IL-1β, प्रो-कॅस्पेस-1, आणि p20 कॅस्पेस-1 यासह मुख्य दाहक प्रथिने NLRP3, वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे आढळून आले.b सुपरनॅटंट्समधील IL-1β च्या स्रावाची पातळी एन्झाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉर्बेंट परख (ELISA) वापरून निर्धारित केली गेली.नियंत्रण आणि प्रायोगिक गटांमधील फरकांचे विश्लेषण SPSS सॉफ्टवेअर आवृत्ती 22.0 वापरून भिन्नता (ANOVA) च्या एकमार्गी विश्लेषणाद्वारे केले गेले.**P<0.01 आणि ***P<0.001 गटांमधील तारा चिन्ह लक्षणीय फरक दर्शवतात.c गोळ्यांमधील एएससी ऑलिगोमेरायझेशन पातळी डीएसएस क्रॉस-लिंकिंग विश्लेषणाद्वारे निर्धारित केली गेली, तर सेल लाइसेट्समधील एएससी पातळी लोडिंग नियंत्रण म्हणून वापरली गेली.d immunofluorescence वापरून ISC स्थानिकीकरणाचे व्हिज्युअलायझेशन.ई इम्युनोफ्लोरेसेन्सचा वापर NLRP3 चे स्थानिकीकरण व्हिज्युअलाइज करण्यासाठी केला गेला.एएससी, ऍपोप्टोटिक स्पेक सारखी प्रथिने;आयएल, इंटरल्यूकिन;NLRP3, न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ऑलिगोमेरायझेशन-सारखे रिसेप्टर 3;ns, लक्षणीय नाही (P > 0.05)
G. duodenalis आणि GEVs हे दोन्ही NLRP3 दाहक क्रिया सक्रिय करतात आणि विट्रोमध्ये यजमान दाहक प्रतिक्रियांचे नियमन करतात.अशाप्रकारे, जी. ड्युओडेनलिसच्या रोगजनकतेमध्ये NLRP3 दाहकची भूमिका अस्पष्ट राहते.या समस्येचा तपास करण्यासाठी, आम्ही G. duodenalis cyst ची लागण झालेले उंदीर आणि G. duodenalis cyst + MCC950 इनहिबिटर उपचाराने संक्रमित उंदीर यांच्यात एक प्रयोग तयार केला आणि G. duodenalis cyst चा संसर्ग झाल्यावर NLRP3 दाहक अभिव्यक्तीची तुलना केली.प्रयोगाची तपशीलवार योजना अंजीर 3a मध्ये दर्शविली आहे.वेगवेगळ्या उपचार गटांमधील उंदरांच्या शरीराच्या वजनातील बदलांचे निरीक्षण गळूंच्या संसर्गानंतर 7 दिवसांपर्यंत केले गेले आणि त्याचे परिणाम चित्र 3b मध्ये दर्शविले गेले आहेत.शुद्ध पीबीएसने उपचार केलेल्या गटाच्या तुलनेत, परिणामांवरून असे दिसून आले की (i) जी. ड्युओडेनालिस सिस्टने संक्रमित उंदरांच्या शरीराचे वजन संक्रमणानंतर 3 दिवसापासून ते 7 व्या दिवसापर्यंत कमी होते;(ii) MCC950 इनहिबिटरच्या उपचाराने उंदरांच्या शरीराच्या वजनावर कोणताही विशेष परिणाम झाला नाही..सिंगल इन्फेक्शन ग्रुपच्या तुलनेत, MCC950 ने उपचार केलेल्या ड्युओडेनल इन्फेक्शन ग्रुपचे BW वेगवेगळ्या प्रमाणात कमी झाले (दिवस 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; दिवस 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; दिवस 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052, ANOVA; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; दिवस 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175 दिवस 7: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202).हे डेटा दाखवतात की NLRP3 इन्फ्लॅमासोम पक्वाशयाच्या संसर्गाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यात (2-4 दिवस) लक्षणीय वजन कमी होण्यापासून उंदरांचे संरक्षण करते.त्यानंतर आम्ही ड्युओडेनल लॅव्हेज फ्लुइडमध्ये G. ड्युओडेनालिस ट्रॉफोझोइट्स शोधण्याचे उद्दिष्ट ठेवले आणि परिणाम आकृती 3c मध्ये दर्शविले आहेत.G. ड्युओडेनलिस सिस्ट इन्फेक्शन ग्रुपच्या तुलनेत, NLRP3 इन्फ्लॅमासोम (t(12) = 2.902, P = 0.0133) अवरोधित केल्यानंतर ड्युओडेनममधील ट्रॉफोझोइट्सची संख्या लक्षणीय वाढली आहे.केवळ PBS आणि MCC950 वर उपचार केलेल्या नकारात्मक नियंत्रणाच्या तुलनेत HE सह डागलेल्या ड्युओडेनल टिश्यूमध्ये असे दिसून आले: (i) G. ड्युओडेनालिस सिस्ट संसर्गामुळे ड्युओडेनल विलीचे नुकसान झाले (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) आणि क्रिप्ट ऍट्रोफी (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) G. duodenalis cysts ची लागण झालेल्या उंदरांच्या ड्युओडेनम आणि MCC950 इनहिबिटरने उपचार केले.ड्युओडेनल विली खराब झाली आणि मृत झाली (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) शोष आणि क्रिप्ट ब्रँचिंगसह (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (चित्र 3d- f) .हे परिणाम सूचित करतात की एनएलआरपी3 जळजळ G. ड्युओडेनालिसची रोगजनकता कमी करण्यात भूमिका बजावते.
जिआर्डिया ड्युओडेनमच्या संसर्गामध्ये NLRP3 दाहक ची भूमिका.उंदरांना ड्युओडेनोकोकल सिस्ट्सने गॅवेज केले गेले (iv) आणि नंतर MCC950 (ip) सह किंवा त्याशिवाय उपचार केले गेले.PBS किंवा MCC950 सह एकल उपचार गट नियंत्रण म्हणून वापरले गेले.प्रायोगिक गट आणि उपचार पथ्ये.b प्रत्येक विविध उपचार गटातील उंदरांच्या शरीराचे वजन 7 दिवसांसाठी निरीक्षण केले गेले.G. duodenalis संसर्ग गट आणि G. duodenalis + MCC950 संसर्ग उपचार गटातील फरक SPSS सॉफ्टवेअर आवृत्ती 22.0 वापरून टी-टेस्टद्वारे विश्लेषित करण्यात आला.एस्टरिस्क *P<0.05, **P<0.01, किंवा ***P<0.001 वर लक्षणीय फरक दर्शवतात.c ड्युओडेनल लॅव्हेज फ्लुइडमध्ये ट्रॉफोझोइट्सची संख्या मोजून परजीवी भार निश्चित केला गेला.G. duodenalis संसर्ग गट आणि G. duodenalis + MCC950 संसर्ग उपचार गटातील फरक SPSS सॉफ्टवेअर आवृत्ती 22.0 वापरून टी-टेस्टद्वारे विश्लेषित करण्यात आला.एस्टरिस्क *P <0.05 वर लक्षणीय फरक दर्शवतात.ड्युओडेनल हिस्टोपॅथॉलॉजीचे हेमॅटॉक्सिलिन आणि इओसिन (H&E) स्टेनिंग परिणाम.लाल बाण विलीचे नुकसान दर्शवतात, हिरवे बाण क्रिप्ट्सचे नुकसान दर्शवतात.स्केल बार: 100 µm.e, f ड्युओडेनल व्हिलस उंची आणि माउस क्रिप्ट उंचीचे सांख्यिकीय विश्लेषण.एस्टरिस्क *P<0.05 आणि **P<0.01 वर लक्षणीय फरक दर्शवतात.परिणाम 7 स्वतंत्र जैविक प्रयोगांमधून घेतले जातात.BW, शरीराचे वजन;ig, इंट्रागॅस्ट्रिक वितरण मार्ग;ip, इंट्रापेरिटोनियल वितरण मार्ग;ns, लक्षणीय नाही (P > 0.05);पीबीएस, फॉस्फेट बफर सलाईन;डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार
IL-1β चे स्राव हे जळजळ सक्रियतेचे वैशिष्ट्य आहे.G. duodenalis alpha-2 giardine आणि alpha-7.3 giardine Vivo मधील NLRP3 होस्ट इन्फ्लेमासोम सक्रिय करतात की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी, आम्ही उपचार न केलेले WT माईस (शॅम ग्रुप) आणि NLRP3 इन्फ्लेमासोम-ब्लॉक केलेले माईस (MCC950 इनहिबिटेड ट्रीटमेंट ग्रुप) वापरले.प्रयोगाची तपशीलवार योजना अंजीर 4a मध्ये दर्शविली आहे.प्रायोगिक गटांमध्ये PBS, G. duodenalis cyst द्वारे gavage उपचार, pcDNA3.1 चे इंट्रामस्क्यूलर इंजेक्शन आणि pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine किंवा pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine चे इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन यांचा समावेश होतो.रीकॉम्बीनंट प्लाझमिडच्या इंट्रामस्क्युलर प्रशासनानंतर 7 व्या दिवशी, सीरम गोळा केला गेला आणि प्रत्येक गटातील IL-1β ची पातळी निर्धारित केली गेली.आकृती 4b मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, MOCK गटात: (i) PBS गटाच्या तुलनेत, pcDNA3.1 उपचाराचा IL-1β स्राव (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998) वर विशेष परिणाम झाला नाही, तथापि, G. duodenalis cyst group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine आणि pcDNA3 मध्ये IL-β स्राव लक्षणीयरीत्या वाढला होता.1- अल्फा-7.3 जिआर्डिनच्या इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शनने सीरम IL-1β पातळीत लक्षणीय वाढ केली (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine प्रेरित उच्च पातळी IL-1β स्राव pcDNA3.1-alpha-2 giardine इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन ग्रुप (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) मध्ये .MCC950 उपचार गट आणि MOCK गटातील प्रत्येक गटाच्या तुलनेत: (i) PBS नियंत्रण गट आणि pcDNA3.1 नियंत्रण गटातील IL-1β स्राव पातळी MCC950 अवरोधक अवरोधित केल्यानंतर काही प्रमाणात कमी झाली, परंतु फरक झाला नाही. लक्षणीय (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 अवरोधित केल्यानंतर., IL-1β स्राव G. duodenalis सिस्ट-संक्रमित गट, pcDNA3.1-alpha-2 giardine गट आणि pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine गट (G. duodenalis: ANOVA, F(9) मध्ये लक्षणीयरीत्या कमी झाला. , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: F95, ) = 3.540, P = 0.0164).हे परिणाम सूचित करतात की अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिन विवोमध्ये एनएलआरपी3 इन्फ्लेमासोमच्या सक्रियतेमध्ये मध्यस्थी करतात.
pcDNA3.1(+)-giardines vivo मध्ये NLRP3 होस्ट इन्फ्लेमासोम सक्रिय करतात.उंदरांना रीकॉम्बीनंट युकेरियोटिक अभिव्यक्ती प्लाझमिड pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine किंवा pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine सह लसीकरण (IM) करण्यात आले आणि नंतर MCC950 (ip; MCC950 गट) किंवा नाही (डमी गट) सह उपचार केले गेले. ).PBS किंवा pcDNA3.1(+) प्लास्मिड उपचार गट नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरला गेला, G. duodenalis सिस्ट उपचार गट सकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरला गेला.प्रायोगिक गट आणि उपचार पथ्ये.b उंदरांमध्ये IL-1β ची सीरम पातळी 7 व्या दिवशी ELISA परखने मोजली गेली.MOCK गटातील गटांमधील फरकांचे विश्लेषण वन-वे ANOVA वापरून केले गेले आणि SPSS सॉफ्टवेअर आवृत्ती 22.0 च्या t-चाचणी वापरून MOCK गट आणि MCC950 गटातील फरकांचे विश्लेषण केले गेले.MOCK गटातील उपचार गट, *P<0.05 आणि ***P<0.001;डॉलर चिन्हे ($) MOCK गटातील प्रत्येक गट आणि P<0.05 वर MCC950 गटातील महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात.सात स्वतंत्र जैविक प्रयोगांचे परिणाम.i, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन, ns, लक्षणीय नाही (P > 0.05)
G. duodenalis infectivity वर NLRP3 होस्ट इन्फ्लेमासोमच्या अल्फा-2 आणि अल्फा-7.3 giardine-मध्यस्थ सक्रियतेच्या प्रभावाची तपासणी करण्यासाठी, आम्ही WT C57BL/6 उंदरांचा वापर केला आणि अल्फा-2 giardine आणि alpha-7.3 giardine इंजेक्ट केले.जी. ड्युओडेनलिस सिस्टच्या गॅस्ट्रिक ट्यूबमधून 3 दिवसांनी प्लाझमिड इंट्रामस्क्युलरली इंजेक्ट करण्यात आले, त्यानंतर 7 दिवस उंदरांचे निरीक्षण करण्यात आले.प्रयोगाची तपशीलवार योजना अंजीर 5a मध्ये दर्शविली आहे.प्रत्येक माऊसच्या शरीराचे वजन दररोज मोजले गेले, गॅस्ट्रिक ट्यूबद्वारे प्रशासनानंतर 7 व्या दिवशी ताज्या पक्वाशयाच्या ऊतींचे नमुने गोळा केले गेले, ट्रॉफोझोइट्सची संख्या मोजली गेली आणि हिस्टोपॅथॉलॉजिकल बदल दिसून आले.आकृती 5b मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, वाढत्या आहार वेळेसह, प्रत्येक गटातील उंदरांचे BW हळूहळू वाढले.G. duodenalis cysts च्या इंट्रागॅस्ट्रिक प्रशासनानंतर 3ऱ्या दिवशी उंदरांचे MT कमी होऊ लागले आणि नंतर हळूहळू वाढले.अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा7.3 जिआर्डिनच्या इंट्रामस्क्यूलर इंजेक्शनद्वारे प्रेरित NLRP3 इन्फ्लॅमासोम सक्रिय केल्याने उंदरांमध्ये वजन कमी होते (दिवस 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.39 = 0 .9754 दिवस 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 दिवस 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; दिवस 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409 दिवस 3 : pcDNA3.1-alpha-2 giardine, A 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 दिवस 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 दिवस 4: pcDNA3.1-अल्फा-अर्डिन, 2 , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, दिवस 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, दिवस 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 दिवस 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 दिवस 6: pcDNA alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, दिवस 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;दिवस 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 दिवस 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.5369, P <0.0001).ड्युओडेनम (Fig. 5c) मध्ये परजीवी लोडचे मूल्यांकन केले गेले.उपचार न केलेले सकारात्मक नियंत्रण आणि रिक्त pcDNA3.1 वेक्टरने इंजेक्शन दिलेल्या गटाच्या तुलनेत, α-2 giardine आणि α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) टोचलेल्या गटांमध्ये G. duodenalis trophozoites ची संख्या लक्षणीयरीत्या कमी झाली. -2 जिआर्डिन : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).याशिवाय, उंदरांमध्ये giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081) पेक्षा giardine alfa-7.3 अधिक संरक्षणात्मक होते.एचई स्टेनिंगचे परिणाम अंजीर मध्ये दर्शविले आहेत.5d–f.अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिनने इंजेक्ट केलेल्या उंदरांना G. ड्युओडेनालिस आणि G. ड्युओडेनालिस इंजेक्ट केलेल्या उंदरांच्या तुलनेत पक्वाशयाच्या ऊतींचे कमी घाव होते, जे व्हिलसच्या नुकसानीमुळे प्रकट होते.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 किंवा P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, = 0.0028 किंवा P = 0.0055) आणि कमी क्रिप्ट ऍट्रोफी (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 किंवा P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 किंवा P = 0.0191).हे परिणाम सूचित करतात की अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा-7,3 जिआर्डिन विवोमध्ये NLRP3 दाहक सक्रिय करून G. duodenalis ची संसर्ग कमी करतात.
G. duodenalis संसर्गामध्ये pcDNA3.1(+)-गियार्डिनची भूमिका.उंदरांना रीकॉम्बिनंट युकेरियोटिक एक्सप्रेशन प्लाझमिड्स pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine किंवा pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine सह लसीकरण (IM) करण्यात आले आणि नंतर G. duodenalis cysts (ig) सह आव्हान दिले.PBS गट आणि pcDNA3.1(+) + ड्युओडेनल सिस्ट उपचार गट नकारात्मक नियंत्रण गट म्हणून वापरला गेला आणि पक्वाशयातील गळू उपचार गट सकारात्मक नियंत्रण गट म्हणून वापरला गेला.प्रायोगिक गट आणि उपचार पथ्ये.b प्रत्येक विविध उपचार गटातील उंदरांच्या एमटीचे आव्हानानंतरचे 7 दिवस परीक्षण करण्यात आले.Asterisks G. duodenalis गट आणि pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine गट, *P <0.05, **P <0.01, आणि ***P <0.001;डॉलर चिन्ह ($) G. duodenalis च्या प्रत्येक गट आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine गट, $$P<0.01 आणि $$$P<0.001 यांच्यातील लक्षणीय फरक दर्शवते.c ड्युओडेनम (3 सेमी लांब) पासून 1 मिली पक्वाशयातील लॅव्हेजमध्ये ट्रॉफोझोइट्सची संख्या मोजून परजीवी भार निर्धारित केला गेला आणि ड्युओडेनमच्या प्रति सेमी परजीवींच्या संख्येनुसार व्यक्त केला गेला.G. duodenalis संसर्ग गट, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine गट आणि pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine गटातील फरकांचे विश्लेषण SPSS सॉफ्टवेअर आवृत्ती 22.0 वापरून वन-वे ANOVA द्वारे केले गेले.तारका **P<0.01 आणि ***P<0.001 वर लक्षणीय फरक दर्शवतात.ड्युओडेनममधील हिस्टोपॅथॉलॉजिकल बदल.लाल बाण विलीचे नुकसान दर्शवतात, हिरवे बाण क्रिप्ट्सचे नुकसान दर्शवतात.स्केल बार: 100 µm.e, f माउस ड्युओडेनल व्हिलस उंची (e) आणि क्रिप्ट उंची (f) चे सांख्यिकीय विश्लेषण.आकृती 1d मधील गटांमधील फरकांचे विश्लेषण SPSS सॉफ्टवेअर आवृत्ती 22.0 वापरून वन-वे ANOVA द्वारे केले गेले.एस्टरिस्क *P<0.05 आणि **P<0.01 वर लक्षणीय फरक दर्शवतात.सात स्वतंत्र जैविक प्रयोगांचे परिणाम.ns, लक्षणीय नाही (P > 0.05)
जिआर्डिया ड्युओडेनम हा मानव आणि इतर सस्तन प्राण्यांचा एक सुप्रसिद्ध आतड्यांसंबंधी परजीवी आहे ज्यामुळे giardiasis होतो.2004 मध्ये, 6 वर्षांपेक्षा जास्त प्रचलित असल्यामुळे, विशेषत: कमी सामाजिक आर्थिक स्थितीच्या समुदायांमध्ये याचा समावेश डब्ल्यूएचओ दुर्लक्षित रोग उपक्रमात करण्यात आला [३२].जी. ड्युओडेनालिस संसर्गास रोगप्रतिकारक प्रतिसादामध्ये जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रणाली महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावते.माऊस मॅक्रोफेजेस बाह्य पेशी सापळे [३३] सोडून जी. ड्युओडेनालिसला गुंतवून मारतात आणि मारतात असे नोंदवले गेले आहे.आमच्या मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की G. duodenalis, एक नॉन-आक्रमक बाह्य परजीवी, p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, आणि NLRP3 दाहक सिग्नलिंग मार्ग माऊस मॅक्रोफेजमध्ये होस्ट दाहक प्रतिसादांचे नियमन करण्यासाठी सक्रिय करते, आणि GEV सोडलेले ही प्रक्रिया वाढवू शकते.13], 24].तथापि, GEV मधील NLRP3 दाहक-नियमित जळजळ आणि giardiasis मध्ये NLRP3 inflammasome ची भूमिका यात नेमकी PAMPs समाविष्ट आहेत हे स्पष्ट करणे बाकी आहे.या दोन प्रश्नांवर प्रकाश टाकण्यासाठी आम्ही हा अभ्यास केला.
NLRP3 इन्फ्लॅमासोम रोगप्रतिकारक पेशींच्या साइटोप्लाझममध्ये स्थित आहे आणि यूरिक ऍसिड क्रिस्टल्स, विष, जीवाणू, विषाणू आणि परजीवी यांसारख्या विविध कणांद्वारे सक्रिय केले जाऊ शकते.बॅक्टेरियाच्या अभ्यासात, विषारी पदार्थ मुख्य PAMPs म्हणून ओळखले गेले आहेत जे दाहक सेन्सर सक्रिय करतात, ज्यामुळे जळजळ आणि सेल मृत्यू होतो [34].स्टॅफिलोकोकस ऑरियस [३५] आणि एस्चेरिचिया कोली [३६] मधील हेमोलिसिन, एन्टरोटॉक्सिन (NHE) [३७] मधील हेमोलिसिन बीएल (एचबीएल) यासारखे काही संरचनात्मकदृष्ट्या वैविध्यपूर्ण विष, NLRP3 दाह सक्रिय करण्यास प्रवृत्त करतात.विषाणूजन्य अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की विषाणूजन्य प्रथिने जसे की SARS-COV-2 लिफाफा (E) प्रोटीन [३८] आणि झिका विषाणू NS5 प्रोटीन [३९] हे NLRP3 रिसेप्टरद्वारे ओळखले जाणारे महत्त्वाचे PAMP आहेत.परजीवी अभ्यासामध्ये, टॉक्सोप्लाझ्मा गोंडी, ट्रायकोमोनास योनिनालिस [४०], ट्रायपॅनोसोमा क्रूझी [४१] आणि लीशमॅनिया [४२] सारख्या यजमान दाहक सक्रियतेशी अनेक परजीवी संबंधित असल्याचे नोंदवले गेले आहे.टॉक्सोप्लाझ्मा गोंडीच्या विषाणूशी संबंधित GRA35, GRA42, आणि GRA43, दाट ग्रॅन्युल प्रथिने, लुईस उंदीर मॅक्रोफेजेस [४३] मध्ये पायरोप्टोसिसच्या प्रवेशासाठी आवश्यक आहेत.याव्यतिरिक्त, काही लीशमॅनिया अभ्यासांनी एनएलआरपी3 इन्फ्लॅमासोममध्ये सामील असलेल्या वैयक्तिक रेणूंवर लक्ष केंद्रित केले आहे, जसे की परजीवी झिल्ली लिपोफॉस्फोग्लाइकन [४४] किंवा जस्त मेटालोप्रोटीज [४५].जीन्सच्या ॲनेक्सिन सारख्या अल्फा-गियार्डिन कुटुंबामध्ये, अल्फा-1 जिआर्डिन हे माऊस मॉडेल [१८] मध्ये G. duodenalis विरुद्ध संरक्षण प्रदान करणारे संभाव्य लस उमेदवार असल्याचे दर्शविले गेले आहे.आमच्या अभ्यासात, आम्ही G. duodenalis virulence factors alpha-2 आणि alpha-7,3 giardines निवडले, जे giardia साठी अद्वितीय आहेत परंतु तुलनेने कमी नोंदवले गेले आहेत.जळजळ सक्रियतेच्या विश्लेषणासाठी हे दोन लक्ष्य जनुक pcDNA3.1(+) युकेरियोटिक अभिव्यक्ती प्रणाली वेक्टरमध्ये क्लोन केले गेले.
आमच्या माऊस मॉडेलमध्ये, क्लीव्ह केलेले कॅस्पेस तुकडे दाहक सक्रियतेचे मार्कर म्हणून काम करतात.उत्तेजित झाल्यावर, NLRP3 ASC शी संवाद साधतो, प्रोकॅस्पेसेसची भरती करतो आणि सक्रिय कॅस्पेस तयार करतो जे प्रो-IL-1β आणि प्रो-IL-18 ला अनुक्रमे -18 आणि परिपक्व IL-1β आणि IL-18 मध्ये जोडतात.इन्फ्लॅमेटरी कॅस्पेसेस (कॅस्पेसेस -1, -4, -5 आणि -11) हे सिस्टीन प्रोटीजचे एक संरक्षित कुटुंब आहे जे जन्मजात संरक्षणासाठी महत्त्वपूर्ण आहेत आणि जळजळ आणि प्रोग्राम केलेल्या सेल मृत्यूमध्ये सामील आहेत [46].कॅनॉनिकल इन्फ्लामासोम्स [४७] द्वारे कॅस्पेस-१ सक्रिय केले जाते, तर कॅस्पेस-४, -५ आणि -११ हे ऍटिपिकल इन्फ्लामासोम्स [४८] च्या निर्मिती दरम्यान क्लीव्ह केले जातात.या अभ्यासात, आम्ही माऊस पेरीटोनियल मॅक्रोफेजचा मॉडेल म्हणून वापर केला आणि G. ड्युओडेनालिस संसर्गाच्या अभ्यासात यजमान NLRP3 दाह सक्रियतेचे मार्कर म्हणून p20 कॅस्पेस-1 क्लीव्हड कॅस्पेस-1 चा तपास केला.परिणामांवरून असे दिसून आले की अनेक अल्फा-गिअर्डिन जळजळांच्या विशिष्ट सक्रियतेसाठी जबाबदार असतात, जे जीवाणू आणि विषाणूंमध्ये सामील असलेल्या प्रमुख विषाणू रेणूंच्या शोधाशी सुसंगत असतात.तथापि, आमचा अभ्यास केवळ एक प्राथमिक स्क्रीन आहे आणि इतर रेणू आहेत जे गैर-शास्त्रीय इन्फ्लामासोम्स सक्रिय करू शकतात, कारण आमच्या मागील अभ्यासात जी. ड्युओडेनालिस संसर्ग [१३] मध्ये शास्त्रीय आणि गैर-शास्त्रीय दोन्ही इन्फ्लामासोम आढळले आहेत.व्युत्पन्न केलेले p20 कॅस्पेस-1 एनएलआरपी3 इन्फ्लॅमासोमशी संबंधित आहे की नाही हे निश्चित करण्यासाठी, आम्ही मुख्य रेणू प्रथिने अभिव्यक्ती पातळी आणि एएससी ऑलिगोमेरायझेशन पातळी निर्धारित करण्यासाठी अल्फा-2 आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिनचे माउस पेरिटोनियल मॅक्रोफेजमध्ये रूपांतरित केले, दोन्ही α-गियार्डिन सक्रिय झाल्याची पुष्टी करते. दाहक NLRP3.आमचे परिणाम मॅन्को-प्रायखोडा इत्यादींपेक्षा थोडे वेगळे आहेत, ज्यांनी नोंदवले की G. muris किंवा E. coli EPEC स्ट्रेनसह Caco-2 पेशींना उत्तेजित केल्याने NLRP3, ASC, आणि caspase-1, ची फ्लोरोसेन्स तीव्रता वाढू शकते. जरी लक्षणीय नसले तरी, G. muris आणि E. coli च्या कॉस्टिम्युलेशनमुळे तीन प्रथिनांचे स्तर कसे वाढले [49].ही विसंगती Giardia प्रजाती, सेल लाइन आणि प्राथमिक पेशींच्या निवडीतील फरकांमुळे असू शकते.आम्ही 5-आठवड्याच्या मादी WT C57BL/6 उंदरांमध्ये MCC950 चा वापर करून vivo assess मध्ये देखील कामगिरी केली, जी G. duodenalis ला अधिक संवेदनाक्षम आहेत.MCC950 एक शक्तिशाली आणि निवडक लहान रेणू NLRP3 अवरोधक आहे जो नॅनोमोलर एकाग्रतेवर कॅनोनिकल आणि गैर-प्रामाणिक NLRP3 सक्रियकरण अवरोधित करतो.MCC950 NLRP3 सक्रियकरण प्रतिबंधित करते परंतु AIM2, NLRC4, आणि NLRP1 दाहक मार्ग किंवा TLR सिग्नलिंग मार्ग [27] च्या सक्रियतेवर परिणाम करत नाही.MCC950 NLRP3 सक्रियकरण अवरोधित करते परंतु NLRP3 आरंभ, K+ प्रवाह, Ca2+ प्रवाह किंवा NLRP3 आणि ASC मधील परस्परसंवाद रोखत नाही;त्याऐवजी, ते एएससी ऑलिगोमेरायझेशन [२७] अवरोधित करून NLRP3 दाहक सक्रियकरण प्रतिबंधित करते.म्हणून, जिआर्डिन इंजेक्शननंतर NLRP3 इन्फ्लॅमासोमची भूमिका निश्चित करण्यासाठी आम्ही इन व्हिव्हो अभ्यासात MCC950 चा वापर केला.सक्रिय कॅस्पेस-1 p10 प्रो-इंफ्लॅमेटरी साइटोकिन्स प्रो-IL-1β आणि प्रो-IL-18 ला परिपक्व IL-1β आणि IL-18 [50] मध्ये तोडते.या अभ्यासात, MCC950 सह किंवा त्याशिवाय जिआर्डिन-उपचार केलेल्या उंदरांमध्ये सीरम IL-1β पातळी NLRP3 इन्फ्लॅमासोम सक्रिय झाले आहे की नाही हे सूचक म्हणून वापरले गेले.अपेक्षेप्रमाणे, MCC950 उपचाराने सीरम IL-1β पातळी लक्षणीयरीत्या कमी केली.हे डेटा स्पष्टपणे दाखवतात की G. duodenalis giardin alfa-2 आणि giardin alfa-7.3 NLRP3 माऊस इन्फ्लेमासोम सक्रिय करण्यास सक्षम आहेत.
गेल्या दशकात जमा झालेल्या महत्त्वपूर्ण डेटाने हे दाखवून दिले आहे की IL-17A हे G. muris विरुद्ध प्रतिकारशक्तीचे प्रमुख नियामक आहे, IL-17RA सिग्नलिंग प्रेरित करते, प्रतिजैविक पेप्टाइड्स तयार करते आणि पूरक सक्रियता नियंत्रित करते [51].तथापि, गिआर्डिया संसर्ग तरुण प्रौढांमध्ये अधिक वारंवार होतो, आणि असे नोंदवले गेले आहे की तरुण उंदरांमध्ये जिआर्डियाचा संसर्ग IL-17A प्रतिसाद सक्रिय करत नाही ज्यामुळे त्याचा संरक्षणात्मक प्रभाव पडतो [52], संशोधकांना इतर इम्युनोमोड्युलेटरी गिआर्डिया शोधण्यास प्रवृत्त करते.हेल्मिन्थ संसर्गाची यंत्रणा.अलीकडील अभ्यासाच्या लेखकांनी नोंदवले आहे की G. muris E. coli EPEC द्वारे NLRP3 inflammasome सक्रिय करू शकते, जे प्रतिजैविक पेप्टाइड्सच्या उत्पादनास प्रोत्साहन देते आणि त्याची संलग्नक क्षमता आणि आतड्यांसंबंधी मार्गातील ट्रोफोझोइट्सची संख्या कमी करते, ज्यामुळे कोलनची तीव्रता कमी होते. बॅसिलीमुळे होणारे रोग [४९].एनएलआरपी 3 जळजळ विविध रोगांच्या विकासामध्ये सामील आहे.अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की स्यूडोमोनास एरुगिनोसा पेशींचा मृत्यू टाळण्यासाठी मॅक्रोफेजमध्ये ऑटोफॅजी ट्रिगर करते आणि ही प्रक्रिया NLRP3 इन्फ्लॅमासोम [53] च्या सक्रियतेवर अवलंबून असते.एन. कॅनिनमसाठी, एनएलआरपी 3 इन्फ्लॅमासोमची प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती-मध्यस्थ सक्रियता यजमानामध्ये त्याची प्रतिकृती मर्यादित करते, ज्यामुळे ते संभाव्य उपचारात्मक लक्ष्य बनते [9].पॅराकोक्सीडिओइड्स ब्रासिलिअन्सिस हे माऊस अस्थिमज्जा-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक पेशींमध्ये NLRP3 इन्फ्लॅमासोमच्या सक्रियतेस प्रेरित करते, परिणामी दाहक साइटोकाइन IL-1β सोडते, जे यजमान संरक्षण [१०] मध्ये महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावते.एल. अमाझोनेसिस, एल. मेजर, एल. ब्राझिलिएन्सिस आणि एल. इन्फंटम चागासी यासह अनेक लीशमॅनिया प्रजाती, मॅक्रोफेजमध्ये एनएलआरपी3 आणि एएससी-आश्रित कॅस्पेस-1 सक्रिय करतात, तसेच लीशमॅनिया संसर्ग देखील करतात.NLRP3/ASC/caspase-1 जनुक [11] मधील उंदरांच्या कमतरतेमध्ये परजीवी प्रतिकृती वाढविली जाते.झांबोनी वगैरे.लेशमॅनिया संसर्गामुळे मॅक्रोफेजेसमध्ये NLRP3 इन्फ्लॅमासोम सक्रिय झाल्याची नोंद झाली आहे, ज्यामुळे इंट्रासेल्युलर परजीवी प्रतिकृती मर्यादित होते.अशाप्रकारे, लीशमॅनिया टाळण्याची रणनीती म्हणून NLRP3 सक्रियकरण प्रतिबंधित करू शकते.व्हिव्हो अभ्यासात, एनएलआरपी 3 इन्फ्लेमासोमने लीशमॅनियाच्या उच्चाटनात योगदान दिले, परंतु ऊतींवर परिणाम झाला नाही [54].याउलट, हेल्मिंथियासिस अभ्यासात, NLRP3 इन्फ्लॅमासोमच्या सक्रियतेने गॅस्ट्रोइंटेस्टाइनल हेल्मिंथियासिस [१२] विरुद्ध यजमानाची संरक्षणात्मक प्रतिकारशक्ती दाबली.शिगेला हा जगभरात अतिसारास कारणीभूत असलेल्या मुख्य जीवाणूंपैकी एक आहे.हे जीवाणू P2X7 रिसेप्टर-मध्यस्थ K+ प्रवाह, प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती, लाइसोसोमल ऍसिडिफिकेशन आणि माइटोकॉन्ड्रियल नुकसान द्वारे IL-1β उत्पादनास प्रेरित करू शकतात.NLRP3 इन्फ्लॅमासोम शिगेला [55] विरूद्ध मॅक्रोफेजेसच्या फॅगोसाइटोसिस आणि जीवाणूनाशक क्रियाकलापांचे नकारात्मकरित्या नियमन करते.प्लाझमोडियम अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की एआयएम 2, एनएलआरपी3 किंवा कॅस्पेस-1 ची कमतरता असलेले उंदीर ज्यामध्ये प्लाझमोडियमचा संसर्ग होतो ते उच्च पातळीचे प्रकार 1 इंटरफेरॉन तयार करतात आणि प्लाझमोडियम संसर्गास अधिक प्रतिरोधक असतात [56].तथापि, उंदरांमध्ये NLRP3 जळजळ होण्याच्या रोगजनक सक्रियतेमध्ये अल्फा-2 जिआर्डिन आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिनची भूमिका अस्पष्ट आहे.
या अभ्यासात, MCC950 द्वारे NLRP3 इन्फ्लॅमासोमच्या प्रतिबंधामुळे BW कमी झाले आणि उंदरांमध्ये आतड्यांसंबंधी लॅव्हेज द्रवपदार्थात ट्रॉफोझोइट्सची संख्या वाढली, परिणामी पक्वाशयाच्या ऊतींमध्ये अधिक गंभीर पॅथॉलॉजिकल बदल झाले.Alpha-2 giardine आणि alpha-7.3 giardine यजमान माऊस NLRP3 इन्फ्लेमासोम सक्रिय करतात, माऊसचे शरीराचे वजन वाढवतात, आतड्यांसंबंधी लॅव्हेज द्रवपदार्थातील ट्रॉफोझोइट्सची संख्या कमी करतात आणि पॅथॉलॉजिकल ड्युओडेनल विकृती कमी करतात.हे परिणाम सूचित करतात की G. duodenalis अल्फा-2 giardine आणि alpha-7,3 giardine द्वारे NLRP3 होस्ट इन्फ्लेमासोम सक्रिय करू शकतात, ज्यामुळे उंदरांमध्ये G. duodenalis ची रोगजनकता कमी होते.
एकत्रितपणे, आमचे परिणाम हे दाखवतात की अल्फा-2 आणि अल्फा-7.3 जिआर्डिन NLRP3 होस्ट इन्फ्लेमासोम सक्रिय करण्यास प्रवृत्त करतात आणि उंदरांमध्ये G. duodenalis ची संसर्ग कमी करतात.म्हणून, हे रेणू गिआर्डियासिसच्या प्रतिबंधासाठी आशादायक लक्ष्य आहेत.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
लिआंग एकेएस, लिआंग एएएम, हुआंग एएचसी, सेर्गी केएम, काम जेकेएम.जिआर्डियासिस: एक विहंगावलोकन.पॅट इन्फ्लॅम या औषधांची ॲलर्जी असल्याचे नुकतेच उघड झाले.2019;13:134–43.
एस्कोबेडो एए, सिमरमन एस. गिआर्डियासिस: फार्माकोथेरपीचे पुनरावलोकन.फार्मासिस्टचे तज्ञांचे मत.2007;८: १८८५-९०२.
तियान हुआफेंग, चेन बिन, वेन जियानफेंग.जिआर्डियासिस, औषधांचा प्रतिकार आणि नवीन लक्ष्यांचा शोध.डिसऑर्डर औषध लक्ष्यांना संक्रमित करते.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, इ. NLRP3 दाहक आणि दाहक रोग.ऑक्साइड मेड सेल Longev.2020;2020:4063562.
चेन GY, Núñez G. आतड्यांसंबंधी जळजळ आणि कर्करोगात दाहकतेची भूमिका.गॅस्ट्रोएन्टेरोलॉजी.2011;१४१:१९८६–९९.
पेलेग्रिनी सी, अँटोनिओली एल, लोपेझ-कास्टेजॉन जी, ब्लॅन्डिझी सी, फोर्नाई एम. कॅनॉनिकल आणि ॲटिपिकल एनएलआरपी3 इम्यून टॉलरन्स आणि आतड्यांच्या जळजळीच्या क्रॉसरोड्सवर दाहक क्रिया.पूर्व-प्रतिकार.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-मध्यस्थ NLRP3 दाहक सक्रियकरण N. कॅनिनम संसर्गाच्या प्रतिसादात सामील आहे.परजीवी वेक्टर.2020; 13:449.