Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही साइटला शैली आणि JavaScript शिवाय रेंडर करू.
फुफ्फुसीय सिस्टिक फायब्रोसिसच्या उपचारांसाठी जनुकीय वाहकांना प्रवाहकीय वायुमार्गांना लक्ष्य करणे आवश्यक आहे, कारण परिधीय फुफ्फुसांच्या ट्रान्सडक्शनचा कोणताही उपचारात्मक प्रभाव नाही.व्हायरल ट्रान्सडक्शनची कार्यक्षमता थेट वाहकाच्या निवासाच्या वेळेशी संबंधित आहे.तथापि, प्रसूतीचे द्रव जसे की जनुक वाहक इनहेलेशन दरम्यान अल्व्होलीमध्ये नैसर्गिकरित्या पसरतात आणि कोणत्याही आकाराचे उपचारात्मक कण म्यूकोसिलरी ट्रान्सपोर्टद्वारे वेगाने काढून टाकले जातात.श्वसनमार्गामध्ये जनुक वाहकांच्या निवासाची वेळ वाढवणे महत्वाचे आहे परंतु साध्य करणे कठीण आहे.वाहक-संयुग्मित चुंबकीय कण जे श्वसनमार्गाच्या पृष्ठभागावर निर्देशित केले जाऊ शकतात ते प्रादेशिक लक्ष्यीकरण सुधारू शकतात.विवो इमेजिंगमधील समस्यांमुळे, लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर अशा लहान चुंबकीय कणांचे वर्तन खराब समजले जाते.विवोमधील एकल आणि बल्क कणांच्या वर्तनाची गतिशीलता आणि नमुने यांचा अभ्यास करण्यासाठी ऍनेस्थेटाइज्ड उंदीरांच्या श्वासनलिकेतील चुंबकीय कणांच्या शृंखला व्हिव्होमध्ये दृश्यमान करण्यासाठी सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग वापरणे हा या अभ्यासाचा उद्देश होता.त्यानंतर आम्ही चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत लेन्टीव्हायरल चुंबकीय कणांचे वितरण उंदराच्या श्वासनलिकेतील ट्रान्सडक्शनची कार्यक्षमता वाढवते का याचे देखील मूल्यांकन केले.सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे इमेजिंग विट्रो आणि व्हिव्होमध्ये स्थिर आणि फिरत्या चुंबकीय क्षेत्रांमधील चुंबकीय कणांचे वर्तन दर्शवते.चुंबकांचा वापर करून जिवंत वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर कण सहजपणे ओढले जाऊ शकत नाहीत, परंतु वाहतूक दरम्यान, ठेवी दृश्याच्या क्षेत्रात केंद्रित असतात, जेथे चुंबकीय क्षेत्र सर्वात मजबूत असते.चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत लेन्टीव्हायरल चुंबकीय कण वितरित केल्यावर ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता देखील सहा पटीने वाढली.एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की व्हिव्होमधील प्रवाहकीय वायुमार्गामध्ये जनुक वेक्टर लक्ष्यीकरण आणि ट्रान्सडक्शन पातळी सुधारण्यासाठी लेन्टीव्हायरल चुंबकीय कण आणि चुंबकीय क्षेत्र बहुमोल मार्ग असू शकतात.
सिस्टिक फायब्रोसिस (CF) हा CF ट्रान्समेम्ब्रेन कंडक्टन्स रेग्युलेटर (CFTR) नावाच्या एकाच जनुकातील फरकांमुळे होतो.सीएफटीआर प्रोटीन हे एक आयन चॅनेल आहे जे सिस्टिक फायब्रोसिसच्या पॅथोजेनेसिसमधील प्रमुख साइट वायुमार्गासह संपूर्ण शरीरातील अनेक उपकला पेशींमध्ये असते.CFTR मधील दोषांमुळे असामान्य जलवाहतूक, वायुमार्गाच्या पृष्ठभागाचे निर्जलीकरण आणि वायुमार्गाच्या पृष्ठभागाच्या द्रवपदार्थाची (ASL) खोली कमी होते.हे श्वासाद्वारे घेतलेले कण आणि रोगजनकांचे वायुमार्ग साफ करण्यासाठी म्यूकोसिलरी ट्रान्सपोर्ट (MCT) प्रणालीची क्षमता देखील बिघडवते.CFTR जनुकाची योग्य प्रत वितरीत करण्यासाठी आणि ASL, MCT, आणि फुफ्फुसाचे आरोग्य सुधारण्यासाठी आणि vivo1 मध्ये या पॅरामीटर्सचे मोजमाप करू शकणारे नवीन तंत्रज्ञान विकसित करणे सुरू ठेवण्यासाठी lentiviral (LV) जीन थेरपी विकसित करणे हे आमचे ध्येय आहे.
LV वेक्टर हे सिस्टिक फायब्रोसिस जनुक थेरपीसाठी अग्रगण्य उमेदवारांपैकी एक आहेत, मुख्यत्वे कारण ते उपचारात्मक जनुक कायमस्वरूपी वायुमार्गाच्या बेसल पेशींमध्ये (एअरवे स्टेम पेशी) समाकलित करू शकतात.हे महत्त्वाचे आहे कारण ते सिस्टिक फायब्रोसिसशी संबंधित कार्यात्मक जनुक-दुरुस्त वायुमार्गाच्या पृष्ठभागाच्या पेशींमध्ये फरक करून सामान्य हायड्रेशन आणि श्लेष्मा क्लिअरन्स पुनर्संचयित करू शकतात, परिणामी आयुष्यभर फायदे होतात.LV वेक्टर्स प्रवाहकीय वायुमार्गावर निर्देशित केले पाहिजेत, कारण येथूनच CF मध्ये फुफ्फुसाचा सहभाग सुरू होतो.वेक्टर फुफ्फुसात खोलवर पोहोचवल्याने अल्व्होलर ट्रान्सडक्शन होऊ शकते, परंतु सिस्टिक फायब्रोसिसमध्ये याचा कोणताही उपचारात्मक परिणाम होत नाही.तथापि, जनुक वाहक यांसारखे द्रव बाळंतपणानंतर श्वास घेत असताना नैसर्गिकरित्या अल्व्होलीमध्ये स्थलांतरित होतात 3,4 आणि उपचारात्मक कण MCTs द्वारे तोंडी पोकळीमध्ये वेगाने बाहेर टाकले जातात.एलव्ही ट्रान्सडक्शनची कार्यक्षमता सेल्युलर अपटेकला परवानगी देण्यासाठी वेक्टर लक्ष्य पेशींच्या जवळ राहण्याच्या कालावधीशी थेट संबंधित आहे - "निवास वेळ" 5 जो विशिष्ट प्रादेशिक वायुप्रवाह तसेच श्लेष्मा आणि MCT कणांच्या समन्वित अपटेकद्वारे सहजपणे कमी केला जातो.सिस्टिक फायब्रोसिससाठी, या भागात उच्च पातळीचे ट्रान्सडक्शन साध्य करण्यासाठी वायुमार्गामध्ये LV निवासाचा कालावधी वाढवण्याची क्षमता महत्त्वाची आहे, परंतु आतापर्यंत ते आव्हानात्मक आहे.
या अडथळ्यावर मात करण्यासाठी, आम्ही प्रस्तावित करतो की LV चुंबकीय कण (MPs) दोन पूरक मार्गांनी मदत करू शकतात.प्रथम, लक्ष्यीकरण सुधारण्यासाठी आणि वायुमार्गाच्या योग्य भागात जनुक वाहक कणांना मदत करण्यासाठी त्यांना चुंबकाद्वारे वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर मार्गदर्शन केले जाऊ शकते;आणि एएसएल) सेल लेयरमध्ये जातात 6. जेव्हा ते ऍन्टीबॉडीज, केमोथेरपी औषधे किंवा इतर लहान रेणूंना बांधतात जे सेल झिल्लीला जोडतात किंवा त्यांच्या संबंधित सेल पृष्ठभागाच्या रिसेप्टर्सला बांधतात आणि ट्यूमर साइटवर जमा होतात तेव्हा लक्ष्यित औषध वितरण वाहने म्हणून एमपीचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो. स्थिर विजेची उपस्थिती.कॅन्सर थेरपीसाठी चुंबकीय क्षेत्रे 7. इतर "हायपरथर्मिक" पद्धतींचा उद्देश एमपी गरम करून ट्यूमर पेशी मारणे आहे जेव्हा दोलन चुंबकीय क्षेत्राच्या संपर्कात येते.चुंबकीय अभिकर्षणाचे तत्त्व, ज्यामध्ये पेशींमध्ये डीएनएचे हस्तांतरण वाढविण्यासाठी चुंबकीय क्षेत्राचा वापर ट्रान्सफेक्शन एजंट म्हणून केला जातो, सामान्यतः विट्रोमध्ये नॉन-व्हायरल आणि विषाणूजन्य जनुक वेक्टरच्या श्रेणीचा वापर करून कठीण-टू-ट्रान्सड्यूस सेल लाइन्ससाठी वापरला जातो. ..स्थिर चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत मानवी ब्रोन्कियल एपिथेलियमच्या सेल लाइनमध्ये विट्रोमध्ये एलव्ही एमपीच्या वितरणासह एलव्ही मॅग्नेटोट्रांसफेक्शनची कार्यक्षमता स्थापित केली गेली, ज्यामुळे केवळ एलव्ही व्हेक्टरच्या तुलनेत ट्रान्सडक्शनची कार्यक्षमता 186 पट वाढली.LV MT हे सिस्टिक फायब्रोसिसच्या इन विट्रो मॉडेलवर देखील लागू केले गेले आहे, जेथे चुंबकीय संक्रमणामुळे सिस्टिक फायब्रोसिस थुंकीच्या उपस्थितीत 20 च्या घटकाने एअर-लिक्विड इंटरफेस कल्चरमध्ये LV ट्रान्सडक्शन वाढले आहे.तथापि, व्हिव्हो ऑर्गन मॅग्नेटोट्रान्सफेक्शनमध्ये तुलनेने कमी लक्ष दिले गेले आहे आणि केवळ काही प्राण्यांच्या अभ्यासात मूल्यांकन केले गेले आहे11,12,13,14,15, विशेषतः फुफ्फुसांमध्ये 16,17.तथापि, सिस्टिक फायब्रोसिसमध्ये फुफ्फुसांच्या थेरपीमध्ये चुंबकीय संक्रमणाची शक्यता स्पष्ट आहे.टॅन वगैरे.(2020) ने म्हटले आहे की "चुंबकीय नॅनोकणांच्या प्रभावी फुफ्फुसीय वितरणावरील प्रमाणीकरण अभ्यासामुळे सिस्टिक फायब्रोसिस असलेल्या रुग्णांमध्ये क्लिनिकल परिणाम सुधारण्यासाठी भविष्यातील CFTR इनहेलेशन धोरणांसाठी मार्ग मोकळा होईल"6.
लागू केलेल्या चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत श्वसनमार्गाच्या पृष्ठभागावर लहान चुंबकीय कणांचे वर्तन दृश्यमान करणे आणि अभ्यास करणे कठीण आहे आणि म्हणूनच ते खराब समजले जाऊ शकतात.इतर अभ्यासांमध्ये, आम्ही थेट गॅस चॅनेल पृष्ठभाग हायड्रेशन मोजण्यासाठी ASL18 खोली आणि MCT19 वर्तन, 20 मधील विवो बदलांमध्ये नॉन-इनवेसिव्ह इमेजिंग आणि मिनिटाच्या प्रमाणासाठी सिंक्रोट्रॉन प्रोपगेशन बेस्ड फेज कॉन्ट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (PB-PCXI) पद्धत विकसित केली आहे. आणि उपचार प्रभावीतेचा प्रारंभिक सूचक म्हणून वापरला जातो.याव्यतिरिक्त, आमची MCT स्कोअरिंग पद्धत PB-PCXI21 सह दृश्यमान MCT मार्कर म्हणून एल्युमिना किंवा उच्च अपवर्तक इंडेक्स ग्लासपासून बनलेले 10-35 µm व्यासाचे कण वापरते.दोन्ही पद्धती MPs सह कण प्रकारांच्या श्रेणी इमेजिंगसाठी योग्य आहेत.
उच्च अवकाशीय आणि ऐहिक रिझोल्यूशनमुळे, आमचे PB-PCXI-आधारित ASL आणि MCT assess व्हिव्होमधील सिंगल आणि बल्क कणांच्या डायनॅमिक्स आणि वर्तणुकीच्या पद्धतींचा अभ्यास करण्यासाठी आम्हाला MP जनुक वितरण पद्धती समजून घेण्यास आणि ऑप्टिमाइझ करण्यात मदत करण्यासाठी योग्य आहेत.आम्ही येथे वापरत असलेला दृष्टीकोन SPring-8 BL20B2 बीमलाइन वापरून आमच्या अभ्यासावर आधारित आहे, ज्यामध्ये आम्ही उंदरांच्या अनुनासिक आणि फुफ्फुसीय वायुमार्गामध्ये डमी वेक्टरचा डोस डिलिव्हरी केल्यानंतर द्रव हालचालीची कल्पना केली आहे ज्यामुळे आमच्या विषम जनुक अभिव्यक्ती नमुन्यांचे निरीक्षण करण्यात आले आहे. आमच्या जीन मध्ये.3.4 च्या वाहक डोससह प्राणी अभ्यास.
या अभ्यासाचे उद्दिष्ट PB-PCXI सिंक्रोट्रॉनचा वापर जिवंत उंदरांच्या श्वासनलिकेतील खासदारांच्या मालिकेच्या व्हिव्हो हालचालींमध्ये दृश्यमान करण्यासाठी होता.हे PB-PCXI इमेजिंग अभ्यास MP शृंखला, चुंबकीय क्षेत्र सामर्थ्य आणि MP हालचालींवर त्यांचा प्रभाव निर्धारित करण्यासाठी स्थान तपासण्यासाठी डिझाइन केले होते.आम्ही असे गृहीत धरले की बाह्य चुंबकीय क्षेत्र वितरित MF ला राहण्यास किंवा लक्ष्य क्षेत्राकडे जाण्यास मदत करेल.या अभ्यासांमुळे आम्हाला चुंबक कॉन्फिगरेशन निर्धारित करण्यास देखील अनुमती मिळाली जी जमा झाल्यानंतर श्वासनलिकेमध्ये उरलेल्या कणांचे प्रमाण वाढवते.अभ्यासाच्या दुसऱ्या मालिकेत, आम्ही या इष्टतम कॉन्फिगरेशनचा वापर करून उंदराच्या वायुमार्गात LV-MPs च्या विवो डिलिव्हरीच्या परिणामी, वायुमार्ग लक्ष्यीकरणाच्या संदर्भात LV-MPs च्या वितरणाचा परिणाम होईल असे गृहीत धरून ट्रान्सडक्शन पॅटर्नचे प्रदर्शन करण्याचे उद्दिष्ट ठेवले होते. वाढीव एलव्ही ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमतेमध्ये..
ॲडलेड विद्यापीठ (M-2019-060 आणि M-2020-022) आणि SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee यांनी मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार सर्व प्राण्यांचे अभ्यास केले गेले.ARRIVE च्या शिफारशींनुसार प्रयोग केले गेले.
सर्व क्ष-किरण प्रतिमा जपानमधील SPring-8 सिंक्रोट्रॉन येथे BL20XU बीमलाइनवर पूर्वी 21,22 वर वर्णन केल्याप्रमाणे सेटअप वापरून घेण्यात आल्या.थोडक्यात, प्रायोगिक बॉक्स सिंक्रोट्रॉन स्टोरेज रिंगपासून 245 मीटर अंतरावर होता.कण इमेजिंग अभ्यासासाठी नमुना-ते-डिटेक्टर अंतर 0.6 मीटर आणि फेज कॉन्ट्रास्ट प्रभाव तयार करण्यासाठी व्हिव्हो इमेजिंग अभ्यासासाठी 0.3 मीटर वापरले जाते.25 keV ऊर्जेसह मोनोक्रोमॅटिक बीम वापरला गेला.उच्च रिझोल्यूशन एक्स-रे ट्रान्सड्यूसर (SPring-8 BM3) आणि sCMOS डिटेक्टर वापरून प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या.ट्रान्सड्यूसर 10 µm जाड सिंटिलेटर (Gd3Al2Ga3O12) वापरून क्ष-किरणांना दृश्यमान प्रकाशात रूपांतरित करतो, जे नंतर ×10 (NA 0.3) सूक्ष्मदर्शक उद्देश वापरून sCMOS सेन्सरकडे निर्देशित केले जाते.sCMOS डिटेक्टर एक Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) होता ज्याचा ॲरे आकार 2048 × 2048 पिक्सेल आणि रॉ पिक्सेल आकार 6.5 × 6.5 µm आहे.हे सेटिंग 0.51 µm चा एक प्रभावी समस्थानिक पिक्सेल आकार आणि अंदाजे 1.1 मिमी × 1.1 मिमीचे दृश्य क्षेत्र देते.100 ms चा एक्सपोजर कालावधी वायुमार्गाच्या आत आणि बाहेरील चुंबकीय कणांचे सिग्नल-टू-आवाज गुणोत्तर वाढवण्यासाठी निवडले गेले आणि श्वासोच्छ्वासामुळे होणारी गती कृत्रिमता कमी केली गेली.विवो अभ्यासासाठी, एक्स-रे बीमला एक्सपोजरच्या दरम्यान अवरोधित करून रेडिएशन डोस मर्यादित करण्यासाठी एक्स-रे मार्गामध्ये एक वेगवान एक्स-रे शटर ठेवण्यात आले होते.
कोणत्याही SPring-8 PB-PCXI इमेजिंग अभ्यासामध्ये LV मीडियाचा वापर केला गेला नाही कारण BL20XU इमेजिंग चेंबर बायोसेफ्टी लेव्हल 2 प्रमाणित नाही.त्याऐवजी, आम्ही आकार, साहित्य, लोह सांद्रता आणि ऍप्लिकेशन्सचा समावेश असलेल्या दोन व्यावसायिक विक्रेत्यांकडून चांगल्या वैशिष्ट्यपूर्ण खासदारांची श्रेणी निवडली - प्रथम काचेच्या केशिकांमधील खासदारांच्या हालचालींवर चुंबकीय क्षेत्र कसा परिणाम करतात हे समजून घेण्यासाठी आणि नंतर जिवंत वायुमार्ग.पृष्ठभागएमपीचा आकार 0.25 ते 18 µm पर्यंत बदलतो आणि विविध सामग्रीपासून बनविला जातो (तक्ता 1 पहा), परंतु एमपीमधील चुंबकीय कणांच्या आकारासह प्रत्येक नमुन्याची रचना अज्ञात आहे.आमच्या विस्तृत MCT अभ्यास 19, 20, 21, 23, 24 च्या आधारे, आम्ही अपेक्षा करतो की श्वासनलिका वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर MP 5 µm पर्यंत खाली दिसू शकतात, उदाहरणार्थ, MP हालचालीची सुधारित दृश्यमानता पाहण्यासाठी सलग फ्रेम्स वजा करून.0.25 µm चा सिंगल MP इमेजिंग यंत्राच्या रिझोल्यूशनपेक्षा लहान आहे, परंतु PB-PCXI ने त्यांचा व्हॉल्यूमेट्रिक कॉन्ट्रास्ट आणि ते जमा केल्यानंतर ज्या पृष्ठभागावरील द्रवाची हालचाल केली जाते ते शोधणे अपेक्षित आहे.
टेबलमधील प्रत्येक खासदाराचे नमुने.1 हे 0.63 मिमीच्या अंतर्गत व्यासासह 20 μl ग्लास केशिका (ड्रमंड मायक्रोकॅप्स, पीए, यूएसए) मध्ये तयार केले गेले.कॉर्पस्क्युलर कण पाण्यात उपलब्ध असतात, तर कॉम्बीमॅग कण उत्पादकाच्या मालकीच्या द्रवामध्ये उपलब्ध असतात.प्रत्येक ट्यूब अर्धी द्रवाने भरलेली असते (अंदाजे 11 μl) आणि नमुना धारकावर ठेवली जाते (आकृती 1 पहा).काचेच्या केशिका अनुक्रमे इमेजिंग चेंबरमध्ये स्टेजवर क्षैतिजरित्या ठेवल्या गेल्या आणि द्रवच्या काठावर ठेवल्या.दुर्मिळ पृथ्वी, निओडीमियम, लोह आणि बोरॉन (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) यापासून बनवलेले 19 मिमी व्यासाचे (28 मिमी लांब) निकेल-शेल चुंबक 1.17 T च्या रीमनन्ससह जोडलेले होते. साध्य करण्यासाठी वेगळे हस्तांतरण सारणी रेंडरिंग दरम्यान तुमची स्थिती दूरस्थपणे बदला.क्ष-किरण इमेजिंग सुरू होते जेव्हा चुंबक नमुन्याच्या अंदाजे 30 मिमी वर स्थित असतो आणि प्रति सेकंद 4 फ्रेम्सवर प्रतिमा प्राप्त केल्या जातात.इमेजिंग दरम्यान, चुंबकाला काचेच्या केशिका नळीजवळ (सुमारे 1 मिमी अंतरावर) आणले गेले आणि नंतर फील्ड ताकद आणि स्थितीच्या प्रभावाचे मूल्यांकन करण्यासाठी ट्यूबच्या बाजूने हलवले गेले.
xy नमुन्याच्या भाषांतराच्या टप्प्यावर काचेच्या केशिकांमधील MP नमुने असलेले इन विट्रो इमेजिंग सेटअप.एक्स-रे बीमचा मार्ग लाल ठिपके असलेल्या रेषेने चिन्हांकित केला आहे.
एकदा खासदारांची इन विट्रो दृश्यमानता स्थापित झाल्यानंतर, त्यांच्यापैकी एका उपसमूहाची विवोमध्ये वन्य-प्रकारच्या मादी विस्टार अल्बिनो उंदीरांवर (~12 आठवडे जुने, ~200 ग्रॅम) चाचणी केली गेली.मेडेटोमिडीन ०.२४ मिग्रॅ/किग्रा (डोमिटोर®, झेनोआक, जपान), मिडाझोलम ३.२ मिग्रॅ/किलो (डॉर्मिकम®, अस्टेलास फार्मा, जपान) आणि बुटोर्फॅनॉल ४ मिग्रॅ/किग्रा (व्हेटोरफेल®, मीजी सेका).इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शनद्वारे फार्मा (जपान) मिश्रणाने उंदरांना भूल देण्यात आली.ऍनेस्थेसियानंतर, श्वासनलिकेच्या सभोवतालची फर काढून, एंडोट्रॅचियल ट्यूब (ET; 16 Ga इंट्राव्हेनस कॅन्युला, टेरुमो बीसीटी) घालून आणि थर्मल बॅग असलेल्या कस्टम-मेड इमेजिंग प्लेटवर त्यांना सुपिन स्थितीत स्थिर करून इमेजिंगसाठी तयार केले गेले. शरीराचे तापमान राखण्यासाठी.22. आकृती 2a मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे क्ष-किरण प्रतिमेवर श्वासनलिका आडव्या संरेखित करण्यासाठी इमेजिंग प्लेट नंतर इमेजिंग बॉक्समधील नमुना स्टेजला थोड्या कोनात जोडली गेली.
(a) SPring-8 इमेजिंग युनिटमधील विवो इमेजिंग सेटअपमध्ये, क्ष-किरण बीमचा मार्ग लाल ठिपके असलेल्या रेषेने चिन्हांकित केला आहे.(b,c) दोन ऑर्थोगोनली आरोहित आयपी कॅमेरे वापरून ट्रेचियल मॅग्नेट लोकॅलायझेशन दूरस्थपणे केले गेले.स्क्रीनवरील प्रतिमेच्या डाव्या बाजूला, आपण डोके धरून ठेवलेला वायर लूप आणि ET ट्यूबच्या आत स्थापित केलेला डिलिव्हरी कॅन्युला पाहू शकता.
100 μl ग्लास सिरिंज वापरून रिमोट कंट्रोल्ड सिरिंज पंप सिस्टीम (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 टयूबिंग (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) शी 30 Ga सुई वापरून जोडली गेली.एंडोट्रॅचियल ट्यूब टाकताना टीप श्वासनलिकेमध्ये योग्य स्थितीत आहे याची खात्री करण्यासाठी ट्यूब चिन्हांकित करा.मायक्रोपंप वापरून, सिरिंज प्लंजर काढून टाकण्यात आले आणि ट्यूबची टीप वितरित करण्यासाठी MP नमुन्यात बुडवली गेली.लोडेड डिलिव्हरी ट्यूब नंतर एंडोट्रॅचियल ट्यूबमध्ये घातली गेली, टीप आमच्या अपेक्षित लागू चुंबकीय क्षेत्राच्या सर्वात मजबूत भागावर ठेवली.आमच्या Arduino-आधारित टायमिंग बॉक्सशी जोडलेल्या ब्रीद डिटेक्टर वापरून प्रतिमा संपादन नियंत्रित केले गेले आणि पॉवरलॅब आणि लॅबचार्ट (एडी इन्स्ट्रुमेंट्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) वापरून सर्व सिग्नल (उदा. तापमान, श्वसन, शटर उघडणे/बंद करणे आणि प्रतिमा संपादन) रेकॉर्ड केले गेले. 22 जेव्हा इमेजिंग जेव्हा गृहनिर्माण अनुपलब्ध होते, तेव्हा दोन IP कॅमेरे (Panasonic BB-SC382) एकमेकांना अंदाजे 90° वर स्थित होते आणि इमेजिंग दरम्यान श्वासनलिकेशी संबंधित चुंबकाची स्थिती नियंत्रित करण्यासाठी वापरले जातात (आकृती 2b, c).मोशन आर्टिफॅक्ट्स कमी करण्यासाठी, टर्मिनल श्वसन प्रवाह पठार दरम्यान प्रति श्वास एक प्रतिमा प्राप्त केली गेली.
चुंबक दुसऱ्या टप्प्याशी संलग्न आहे, जो इमेजिंग बॉडीच्या बाहेरील बाजूस दूरस्थपणे स्थित असू शकतो.चुंबकाच्या विविध पोझिशन्स आणि कॉन्फिगरेशनची चाचणी घेण्यात आली, यासह: श्वासनलिका वर अंदाजे 30° कोनात ठेवले (कॉन्फिगरेशन आकृती 2a आणि 3a मध्ये दर्शविलेले आहेत);एक चुंबक प्राण्यांच्या वर आणि दुसरा खाली, आकर्षणासाठी ध्रुवांसह (आकृती 3b)., प्राण्याच्या वर एक चुंबक आणि एक खाली, ध्रुव प्रतिकर्षणासाठी सेट केलेले (आकृती 3c), आणि एक चुंबक वर आणि श्वासनलिकेला लंब (आकृती 3d).प्राणी आणि चुंबक सेट केल्यानंतर आणि सिरिंज पंपमध्ये चाचणी अंतर्गत MP लोड केल्यानंतर, प्रतिमा संपादन केल्यावर 4 μl/सेकंद दराने 50 μl चा डोस द्या.चुंबक नंतर प्रतिमा मिळवत असताना श्वासनलिकेच्या बाजूने किंवा पुढे मागे हलवले जाते.
इन व्हिव्हो इमेजिंगसाठी मॅग्नेट कॉन्फिगरेशन (a) श्वासनलिकेच्या वर अंदाजे 30° कोनात एक चुंबक, (b) आकर्षणासाठी कॉन्फिगर केलेले दोन चुंबक, (c) प्रतिकर्षणासाठी कॉन्फिगर केलेले दोन चुंबक, (d) वर एक चुंबक आणि लंबवत श्वासनलिकानिरीक्षकाने तोंडातून खाली श्वासनलिकेतून फुफ्फुसापर्यंत पाहिले आणि क्ष-किरण किरण उंदराच्या डाव्या बाजूने गेले आणि उजव्या बाजूने बाहेर पडले.चुंबक एकतर वायुमार्गाच्या लांबीच्या बाजूने हलविला जातो किंवा क्ष-किरण बीमच्या दिशेने श्वासनलिकेच्या वर डावीकडे आणि उजवीकडे हलविला जातो.
श्वसनमार्ग आणि हृदय गती यांचे मिश्रण नसतानाही आम्ही वायुमार्गातील कणांची दृश्यमानता आणि वर्तन निश्चित करण्याचा प्रयत्न केला.म्हणून, इमेजिंग कालावधीच्या शेवटी, पेंटोबार्बिटल ओव्हरडोस (सोमनोपेंटाइल, पिटमॅन-मूर, वॉशिंग्टन क्रॉसिंग, यूएसए; ~65 mg/kg ip) मुळे प्राण्यांना मानवतेने euthanized करण्यात आले.काही प्राणी इमेजिंग प्लॅटफॉर्मवर सोडले गेले आणि श्वासोच्छ्वास आणि हृदयाचे ठोके बंद झाल्यानंतर, इमेजिंग प्रक्रियेची पुनरावृत्ती झाली, जर वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर MP दिसत नसेल तर एमपीचा अतिरिक्त डोस जोडला गेला.
परिणामी प्रतिमा सपाट आणि गडद क्षेत्रासाठी दुरुस्त केल्या गेल्या आणि नंतर MATLAB (R2020a, The Mathworks) मध्ये लिहिलेल्या सानुकूल स्क्रिप्टचा वापर करून (20 फ्रेम्स प्रति सेकंद; 15-25 × सामान्य गती श्वसन दरावर अवलंबून) चित्रपटात एकत्र केल्या.
एलव्ही जीन व्हेक्टर डिलिव्हरीवरील सर्व अभ्यास ॲडलेड प्रयोगशाळा प्राणी संशोधन केंद्र विद्यापीठात आयोजित करण्यात आले होते आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत एलव्ही-एमपी डिलिव्हरी विवोमध्ये जीन हस्तांतरण वाढवू शकते की नाही हे मूल्यांकन करण्यासाठी स्प्रिंग-8 प्रयोगाचे परिणाम वापरण्याचे उद्दिष्ट होते. .एमएफ आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या प्रभावांचे मूल्यांकन करण्यासाठी, प्राण्यांच्या दोन गटांवर उपचार केले गेले: एका गटाला चुंबक प्लेसमेंटसह एलव्ही एमएफ इंजेक्शन दिले गेले आणि दुसऱ्या गटाला चुंबकाशिवाय एलव्ही एमएफ असलेल्या नियंत्रण गटासह इंजेक्शन दिले गेले.
LV जनुक वेक्टर पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धती 25, 26 वापरून व्युत्पन्न केले गेले आहेत.LacZ वेक्टर MPSV कॉन्स्टिव्हेट प्रमोटर (LV-LacZ) द्वारे चालवलेले न्यूक्लियर लोकॅलाइज्ड बीटा-गॅलॅक्टोसिडेस जनुक व्यक्त करतो, जे ट्रान्सड्यूस केलेल्या पेशींमध्ये निळ्या प्रतिक्रिया उत्पादनाची निर्मिती करते, फुफ्फुसाच्या ऊतींच्या समोर आणि भागांवर दृश्यमान असते.TU/ml मध्ये टायटरची गणना करण्यासाठी हेमोसाइटोमीटर वापरून LacZ-पॉझिटिव्ह पेशींची संख्या मॅन्युअली मोजून सेल कल्चरमध्ये टायट्रेशन केले गेले.वाहकांना -80°C वर क्रायोप्रीझर्व केले जाते, वापरण्यापूर्वी वितळवले जाते, आणि 1:1 मिक्स करून आणि डिलिव्हरीपूर्वी किमान 30 मिनिटे बर्फावर उष्मायन करून CombiMag ला बांधले जाते.
सामान्य स्प्रेग डॉली उंदीर (n = 3/गट, ~2-3 ऍनेस्थेटाइज्ड ip 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) आणि 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) 1 महिन्याच्या वयात) ip ) इंजेक्शन आणि 16 Ga इंट्राव्हेनस कॅन्युलासह नॉन-सर्जिकल ओरल कॅन्युलेशन.श्वासनलिका वायुमार्गाच्या ऊतींना LV ट्रान्सडक्शन प्राप्त होते याची खात्री करण्यासाठी, आमच्या पूर्वी वर्णन केलेल्या यांत्रिक विक्षिप्त प्रोटोकॉलचा वापर करून ते कंडिशन केलेले होते ज्यामध्ये श्वासनलिका वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावर वायर टोपली (N-Circle, nitinol stone extractor without tip NTSE-022115 ) -UDH. कुक मेडिकल, यूएसए) 30 p28.त्यानंतर, जैवसुरक्षा कॅबिनेटमध्ये गोंधळ झाल्यानंतर सुमारे 10 मिनिटांनंतर, LV-MP चे श्वासनलिका प्रशासन केले गेले.
या प्रयोगात वापरलेले चुंबकीय क्षेत्र विवो क्ष-किरण अभ्यासाप्रमाणेच कॉन्फिगर केले गेले होते, त्याच चुंबकांना श्वासनलिकेवर डिस्टिलेशन स्टेंट क्लॅम्प्स (आकृती 4) सह धरले होते.LV-MP चा 50 μl व्हॉल्यूम (2 x 25 μl aliquots) पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे जेल-टिप्ड पिपेट वापरून श्वासनलिका (n = 3 प्राणी) मध्ये वितरित केला गेला.नियंत्रण गटाला (n = 3 प्राणी) चुंबकाचा वापर न करता समान LV-MP प्राप्त झाले.ओतणे पूर्ण झाल्यानंतर, कॅन्युला एंडोट्रॅचियल ट्यूबमधून काढला जातो आणि प्राणी बाहेर काढला जातो.चुंबक काढून टाकण्यापूर्वी 10 मिनिटे जागेवर राहते.उंदरांना मेलोक्सिकॅम (1 मिली/किलो) (इलियम, ऑस्ट्रेलिया) सह त्वचेखालील डोस देण्यात आला आणि त्यानंतर 1 मिलीग्राम/किलो एटिपामाझोल हायड्रोक्लोराईड (अँटीसेडन, झोएटिस, ऑस्ट्रेलिया) च्या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शनद्वारे भूल काढून टाकण्यात आली.भूल देऊन पूर्ण पुनर्प्राप्ती होईपर्यंत उंदीर उबदार ठेवण्यात आले आणि त्यांचे निरीक्षण केले गेले.
जैविक सुरक्षा कॅबिनेटमध्ये एलव्ही-एमपी डिलिव्हरी डिव्हाइस.तुम्ही पाहू शकता की ET ट्यूबचा हलका राखाडी लुअर-लॉक स्लीव्ह तोंडातून बाहेर येतो आणि आकृतीमध्ये दर्शविलेली जेल पिपेट टीप ET ट्यूबद्वारे श्वासनलिकेमध्ये इच्छित खोलीपर्यंत घातली जाते.
LV-MP प्रशासनाच्या प्रक्रियेनंतर एका आठवड्यानंतर, 100% CO2 च्या इनहेलेशनद्वारे प्राण्यांचा मानवतेने बळी दिला गेला आणि आमच्या मानक X-gal उपचार वापरून LacZ अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन केले गेले.एन्डोट्रॅचियल ट्यूब प्लेसमेंटमुळे कोणतेही यांत्रिक नुकसान किंवा द्रव धारणा विश्लेषणामध्ये समाविष्ट होणार नाही याची खात्री करण्यासाठी तीन सर्वात पुच्छ उपास्थि रिंग काढल्या गेल्या.विश्लेषणासाठी दोन भाग मिळविण्यासाठी प्रत्येक श्वासनलिका लांबीच्या दिशेने कापली गेली आणि ल्युमिनल पृष्ठभागाची कल्पना करण्यासाठी मिनीटियन सुई (फाईन सायन्स टूल्स) वापरून सिलिकॉन रबर (सिलगार्ड, डो इंक) असलेल्या कपमध्ये ठेवली गेली.डिजीलाइट कॅमेरा आणि TCapture सॉफ्टवेअर (टक्सेन फोटोनिक्स, चायना) सह Nikon मायक्रोस्कोप (SMZ1500) वापरून फ्रंटल फोटोग्राफीद्वारे ट्रान्सड्यूस केलेल्या पेशींचे वितरण आणि वर्ण पुष्टी केली गेली.20x मोठेपणाने (श्वासनलिकेच्या पूर्ण रुंदीसाठी कमाल सेटिंगसह) प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या, श्वासनलिकेची संपूर्ण लांबी चरण-दर-चरण प्रदर्शित केली गेली, ज्यामुळे प्रतिमा "टाकल्या" जाण्यासाठी प्रत्येक प्रतिमेमध्ये पुरेसा ओव्हरलॅप प्रदान केला गेला.प्लॅनर मोशन अल्गोरिदम वापरून कंपोझिट इमेज एडिटर आवृत्ती 2.0.3 (मायक्रोसॉफ्ट रिसर्च) वापरून प्रत्येक श्वासनलिकेतील प्रतिमा एका संमिश्र प्रतिमेमध्ये एकत्र केल्या गेल्या. 0.35 < ह्यू < 0.58, संपृक्तता > 0.15, आणि मूल्य < 0.7 च्या सेटिंग्ज वापरून, प्रत्येक प्राण्याच्या श्वासनलिका संमिश्र प्रतिमांमधील LacZ अभिव्यक्तीचे क्षेत्र स्वयंचलित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) वापरून परिमाणित केले गेले. 0.35 < ह्यू < 0.58, संपृक्तता > 0.15 आणि मूल्य < 0.7 च्या सेटिंग्ज वापरून, पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे, प्रत्येक प्राण्यातील श्वासनलिका संमिश्र प्रतिमांमधील LacZ अभिव्यक्तीचे क्षेत्र स्वयंचलित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) वापरून परिमाणित केले गेले. Площадь экспрессии लॅकझेड нария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 <0,15 ,7. 0.35 च्या सेटिंग्जचा वापर करून आधी वर्णन केल्याप्रमाणे स्वयंचलित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) वापरून प्रत्येक प्राण्यातील संमिश्र श्वासनलिका प्रतिमांमधील LacZ अभिव्यक्तीचे क्षेत्रफळ मोजले गेले.0.15 आणि मूल्य<0 .7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管只动物的气管复合图像茟臡御合图像茟中化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置.如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。 .. ................ Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . प्रत्येक प्राण्याच्या श्वासनलिकेच्या संमिश्र प्रतिमांवर LacZ अभिव्यक्तीचे क्षेत्र स्वयंचलित MATLAB स्क्रिप्ट (R2020a, MathWorks) वापरून 0.35 < hue < 0.58, संपृक्तता > 0.15 आणि मूल्य < 0.7 च्या सेटिंग्ज वापरून वर्णन केल्याप्रमाणे मोजले गेले.GIMP v2.10.24 मधील टिश्यू कॉन्टूर्सचा मागोवा घेऊन, ऊतक क्षेत्र ओळखण्यासाठी आणि श्वासनलिकेच्या ऊतकांच्या बाहेर कोणतेही खोटे शोध टाळण्यासाठी प्रत्येक संमिश्र प्रतिमेसाठी एक मुखवटा मॅन्युअली तयार केला गेला.प्रत्येक प्राण्याच्या सर्व संमिश्र प्रतिमांमधील डाग असलेल्या भागांची बेरीज त्या प्राण्याचे एकूण डाग असलेले क्षेत्रफळ देण्यासाठी करण्यात आली.सामान्यीकृत क्षेत्र मिळविण्यासाठी पेंट केलेले क्षेत्र नंतर मुखवटाच्या एकूण क्षेत्राद्वारे विभागले गेले.
प्रत्येक श्वासनलिका पॅराफिनमध्ये एम्बेड केलेली होती आणि 5 µm जाडीची विभागणी केली होती.विभागांना 5 मिनिटांसाठी तटस्थ जलद लाल रंगाने काउंटरस्टेन करण्यात आले आणि Nikon Eclipse E400 मायक्रोस्कोप, DS-Fi3 कॅमेरा आणि NIS एलिमेंट कॅप्चर सॉफ्टवेअर (आवृत्ती 5.20.00) वापरून प्रतिमा मिळवण्यात आल्या.
सर्व सांख्यिकीय विश्लेषणे ग्राफपॅड प्रिझम v9 (GraphPad Software, Inc.) मध्ये केली गेली.सांख्यिकीय महत्त्व p ≤ 0.05 वर सेट केले होते.शापिरो-विल्क चाचणी वापरून सामान्यतेची चाचणी केली गेली आणि लॅकझेड स्टेनिंगमधील फरक अनपेअर टी-टेस्ट वापरून मूल्यांकन केले गेले.
तक्ता 1 मध्ये वर्णन केलेल्या सहा खासदारांचे PCXI द्वारे परीक्षण केले गेले आणि दृश्यमानतेचे वर्णन तक्ता 2 मध्ये केले आहे. PCXI द्वारे दोन पॉलिस्टीरिन एमपी (MP1 आणि MP2; अनुक्रमे 18 µm आणि 0.25 µm) दृश्यमान नव्हते, परंतु उर्वरित नमुने ओळखले जाऊ शकतात. (उदाहरणे आकृती 5 मध्ये दर्शविली आहेत).MP3 आणि MP4 कमकुवतपणे दृश्यमान आहेत (अनुक्रमे 10-15% Fe3O4; 0.25 µm आणि 0.9 µm).MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) मध्ये चाचणी केलेले काही लहान कण असले तरी ते सर्वात स्पष्ट होते.CombiMag MP6 उत्पादन वेगळे करणे कठीण आहे.सर्व प्रकरणांमध्ये, केशिकाच्या समांतर चुंबकाला पुढे-मागे हलवून MF शोधण्याची आमची क्षमता मोठ्या प्रमाणात सुधारली गेली.केशिकापासून चुंबक दूर गेल्याने, कण लांब साखळदंडांमध्ये बाहेर काढले गेले, परंतु चुंबक जवळ आले आणि चुंबकीय क्षेत्राची ताकद वाढली, कण केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागाकडे स्थलांतरित झाल्यामुळे कणांच्या साखळ्या लहान झाल्या (पूरक व्हिडिओ S1 पहा. : MP4), पृष्ठभागावरील कणांची घनता वाढवणे.याउलट, जेव्हा केशिकामधून चुंबक काढला जातो, तेव्हा फील्डची ताकद कमी होते आणि केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागापासून विस्तारलेल्या लांब साखळ्यांमध्ये MPs पुनर्रचना करतात (पूरक व्हिडिओ S2: MP4 पहा).चुंबकाची हालचाल थांबल्यानंतर, समतोल स्थितीत पोहोचल्यानंतर कण काही काळ हालचाल करत राहतात.एमपी केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागाच्या दिशेने आणि दूर जात असताना, चुंबकीय कण द्रवमधून मलबा काढतात.
PCXI अंतर्गत MP ची दृश्यमानता नमुन्यांमध्ये लक्षणीयरीत्या बदलते.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 आणि (d) MP6.येथे दर्शविलेल्या सर्व प्रतिमा थेट केशिकाच्या वर अंदाजे 10 मिमी स्थित चुंबकाने घेतल्या गेल्या आहेत.उघड मोठे वर्तुळ हे केशिकामध्ये अडकलेले हवेचे फुगे आहेत, जे स्पष्टपणे फेज कॉन्ट्रास्ट इमेजच्या काळ्या आणि पांढऱ्या काठाची वैशिष्ट्ये दर्शवतात.लाल बॉक्स मोठेपणा दर्शवितो जे कॉन्ट्रास्ट वाढवते.लक्षात घ्या की सर्व आकृत्यांमधील चुंबक सर्किट्सचा व्यास मोजण्यासाठी नाही आणि दर्शविलेल्यापेक्षा अंदाजे 100 पट मोठा आहे.
चुंबक केशिकाच्या वरच्या बाजूने डावीकडे आणि उजवीकडे सरकत असताना, एमपी स्ट्रिंगचा कोन चुंबकाशी संरेखित होण्यासाठी बदलतो (आकृती 6 पहा), अशा प्रकारे चुंबकीय क्षेत्र रेषा रेखाटतात.MP3-5 साठी, जीवा थ्रेशोल्ड कोनात पोहोचल्यानंतर, कण केशिकाच्या वरच्या पृष्ठभागावर ड्रॅग करतात.याचा परिणाम बहुतेकदा ज्या ठिकाणी चुंबकीय क्षेत्र सर्वात मजबूत आहे त्या ठिकाणी खासदार मोठ्या गटांमध्ये एकत्र होतात (पूरक व्हिडिओ S3: MP5 पहा).हे विशेषत: केशिकाच्या शेवटच्या जवळ इमेजिंग करताना देखील स्पष्ट होते, ज्यामुळे एमपी द्रव-एअर इंटरफेसवर एकत्रित आणि केंद्रित होते.MP6 मधील कण, जे MP3-5 मधील कणांपेक्षा वेगळे करणे कठिण होते, जेव्हा चुंबक केशिकाच्या बाजूने सरकले तेव्हा ते ड्रॅग करत नाहीत, परंतु MP स्ट्रिंग्स विलग होतात, ज्यामुळे कण दृश्यात राहतात (पूरक व्हिडिओ S4: MP6 पहा).काही प्रकरणांमध्ये, जेव्हा चुंबकाला इमेजिंग साइटपासून लांब हलवून लागू केलेले चुंबकीय क्षेत्र कमी केले जाते, तेव्हा कोणतेही उर्वरित खासदार हळूहळू गुरुत्वाकर्षणाने ट्यूबच्या खालच्या पृष्ठभागावर उतरतात, स्ट्रिंगमध्येच राहतात (पूरक व्हिडिओ S5: MP3 पहा) .
एमपी स्ट्रिंगचा कोन बदलतो कारण चुंबक केशिकाच्या वर उजवीकडे सरकतो.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 आणि (d) MP6.लाल बॉक्स मोठेपणा दर्शवितो जे कॉन्ट्रास्ट वाढवते.कृपया लक्षात घ्या की अतिरिक्त व्हिडिओ माहितीच्या उद्देशाने आहेत कारण ते महत्त्वपूर्ण कण रचना आणि गतिशील माहिती प्रकट करतात जी या स्थिर प्रतिमांमध्ये दृश्यमान होऊ शकत नाहीत.
आमच्या चाचण्यांमधून असे दिसून आले आहे की श्वासनलिकेच्या बाजूने चुंबकाला हळू हळू पुढे आणि पुढे नेल्याने व्हिव्होमधील जटिल हालचालींच्या संदर्भात MF चे दृश्यमान करणे सुलभ होते.पॉलीस्टीरिन बीड्स (MP1 आणि MP2) केशिकामध्ये दिसत नसल्यामुळे vivo चाचण्या केल्या गेल्या नाहीत.उर्वरित चार MF पैकी प्रत्येकाची चाचणी श्वासनलिकेवर श्वासनलिकेवर उभ्या असलेल्या चुंबकाच्या लांब अक्षासह करण्यात आली (आकृती 2b आणि 3a पहा), कारण याचा परिणाम MF चेन लांब झाला आणि अधिक प्रभावी होता. चुंबकापेक्षा..कॉन्फिगरेशन समाप्त केले.MP3, MP4 आणि MP6 कोणत्याही जिवंत प्राण्यांच्या श्वासनलिकेमध्ये आढळले नाहीत.प्राण्यांना मानवी पद्धतीने मारल्यानंतर उंदरांच्या श्वसनमार्गाचे दृश्य पाहताना, सिरिंज पंप वापरून अतिरिक्त व्हॉल्यूम जोडले गेले तरीही कण अदृश्य राहिले.MP5 मध्ये आयर्न ऑक्साईडचे प्रमाण सर्वाधिक होते आणि ते एकमेव दृश्यमान कण होते, म्हणून त्याचा उपयोग vivo मधील MP वर्तनाचे मूल्यमापन करण्यासाठी आणि वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी केला गेला.
MF अंतर्भूत करताना श्वासनलिकेवर चुंबकाच्या स्थानामुळे अनेक MF दृश्याच्या क्षेत्रात केंद्रित झाले, परंतु सर्वच नाही.कणांची श्वासनलिका प्रवेश मानवतेने euthanized प्राण्यांमध्ये उत्तम प्रकारे साजरा केला जातो.आकृती 7 आणि पूरक व्हिडिओ S6: MP5 वेगवान चुंबकीय कॅप्चर आणि वेंट्रल श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर कणांचे संरेखन दर्शविते, जे दर्शविते की एमपी श्वासनलिकेच्या इच्छित भागात लक्ष्यित केले जाऊ शकतात.MF डिलिव्हरीनंतर श्वासनलिकेच्या बाजूने अधिक दूरवर शोध घेत असताना, काही MF कॅरिना जवळ आढळले, जे सर्व MF गोळा करण्यासाठी आणि ठेवण्यासाठी अपुरी चुंबकीय क्षेत्र शक्ती दर्शवते, कारण ते द्रवपदार्थ प्रशासनादरम्यान जास्तीत जास्त चुंबकीय क्षेत्र शक्तीच्या प्रदेशातून वितरित केले गेले होते.प्रक्रियातथापि, प्रसवोत्तर MP सांद्रता प्रतिमा क्षेत्राभोवती जास्त होती, असे सूचित करते की अनेक खासदार वायुमार्गाच्या प्रदेशात राहिले जेथे लागू चुंबकीय क्षेत्राची ताकद सर्वाधिक होती.
इमेजिंग क्षेत्राच्या अगदी वर ठेवलेल्या चुंबकासह अलीकडेच युथनाइज्ड उंदराच्या श्वासनलिकेमध्ये MP5 डिलिव्हरी करण्यापूर्वी (a) आणि (b) च्या प्रतिमा.चित्रित क्षेत्र दोन कार्टिलागिनस रिंग दरम्यान स्थित आहे.खासदार प्रसूतीपूर्वी वायुमार्गात काही द्रव आहे.लाल बॉक्स मोठेपणा दर्शवितो जे कॉन्ट्रास्ट वाढवते.या प्रतिमा S6: MP5 पूरक व्हिडिओमध्ये वैशिष्ट्यीकृत व्हिडिओमधून घेतल्या आहेत.
व्हिव्होमध्ये श्वासनलिकेच्या बाजूने चुंबक हलवल्यामुळे वायुमार्गाच्या पृष्ठभागावरील MP साखळीच्या कोनात बदल झाला, जो केशिकांमध्ये आढळून येतो (आकृती 8 आणि पूरक व्हिडिओ S7: MP5 पहा).तथापि, आमच्या अभ्यासात, खासदारांना जिवंत श्वसनमार्गाच्या पृष्ठभागावर ओढले जाऊ शकत नाही, जसे केशिका करू शकतात.काही प्रकरणांमध्ये, चुंबक डावीकडे आणि उजवीकडे सरकत असताना एमपी चेन लांबते.विशेष म्हणजे, आम्हाला असेही आढळून आले की जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेच्या बाजूने रेखांशाने हलविला जातो तेव्हा कण शृंखला द्रवपदार्थाच्या पृष्ठभागाच्या थराची खोली बदलते आणि जेव्हा चुंबक थेट वरच्या बाजूला हलविला जातो आणि कण साखळी उभ्या स्थितीत फिरवली जाते तेव्हा ती विस्तृत होते (पहा पूरक व्हिडिओ S7).: MP5 वाजता 0:09, तळाशी उजवीकडे).जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेच्या वरच्या बाजूने (म्हणजे, श्वासनलिकेच्या लांबीच्या बाजूने न जाता प्राण्यांच्या डावीकडे किंवा उजवीकडे) हलविला गेला तेव्हा वैशिष्ट्यपूर्ण हालचालीची पद्धत बदलली.त्यांच्या हालचाली दरम्यान कण अजूनही स्पष्टपणे दृश्यमान होते, परंतु जेव्हा चुंबक श्वासनलिकेतून काढला गेला तेव्हा कणांच्या तारांच्या टिपा दृश्यमान झाल्या (पूरक व्हिडिओ पहा S8: MP5, 0:08 वाजता सुरू होणारा).हे काचेच्या केशिकामध्ये लागू चुंबकीय क्षेत्राच्या कृती अंतर्गत चुंबकीय क्षेत्राच्या निरीक्षण वर्तनाशी सहमत आहे.
जिवंत भूल दिलेल्या उंदराच्या श्वासनलिकेमध्ये MP5 दर्शविणारी नमुना प्रतिमा.(a) चुंबकाचा वापर श्वासनलिकेच्या वर आणि डावीकडे प्रतिमा घेण्यासाठी केला जातो, नंतर (b) चुंबकाला उजवीकडे हलवल्यानंतर.लाल बॉक्स मोठेपणा दर्शवितो जे कॉन्ट्रास्ट वाढवते.या प्रतिमा S7 च्या पूरक व्हिडिओ: MP5 मध्ये वैशिष्ट्यीकृत व्हिडिओमधील आहेत.
जेव्हा दोन ध्रुवांना श्वासनलिकेच्या वर आणि खाली उत्तर-दक्षिण अभिमुखतेमध्ये ट्यून केले गेले (म्हणजे आकर्षित करणारे; चित्र 3b), तेव्हा एमपी कॉर्ड्स लांब दिसू लागले आणि श्वासनलिकेच्या पृष्ठीय पृष्ठभागाच्या ऐवजी श्वासनलिकेच्या पार्श्व भिंतीवर स्थित होते. श्वासनलिका (परिशिष्ट पहा).व्हिडिओ S9:MP5).तथापि, एका ठिकाणी (म्हणजे श्वासनलिकेच्या पृष्ठीय पृष्ठभागावर) कणांची उच्च सांद्रता दुहेरी चुंबक उपकरण वापरून द्रव प्रशासनानंतर आढळून आली नाही, जे सहसा एकाच चुंबक उपकरणासह आढळते.त्यानंतर, जेव्हा एका चुंबकाला विरुद्ध ध्रुवांना मागे टाकण्यासाठी कॉन्फिगर केले गेले (आकृती 3c), दृश्याच्या क्षेत्रात दृश्यमान कणांची संख्या वितरणानंतर वाढली नाही.चुंबकांना अनुक्रमे आकर्षित किंवा ढकलणाऱ्या उच्च चुंबकीय क्षेत्र शक्तीमुळे दोन्ही चुंबक कॉन्फिगरेशन सेट करणे आव्हानात्मक आहे.नंतर सेटअप वायुमार्गाच्या समांतर एका चुंबकात बदलला गेला परंतु वायुमार्गातून 90 अंश कोनात जात होता जेणेकरून शक्तीच्या रेषा श्वासनलिकेच्या भिंतीला ऑर्थोगोनली ओलांडतात (आकृती 3d), एक अभिमुखता कण एकत्रीकरणाची शक्यता निर्धारित करण्यासाठी बाजूकडील भिंत.निरीक्षण करणे.तथापि, या कॉन्फिगरेशनमध्ये, कोणतीही ओळखण्यायोग्य MF जमा हालचाल किंवा चुंबकाची हालचाल नव्हती.या सर्व परिणामांच्या आधारे, जनुक वाहकांच्या विवो अभ्यासासाठी (चित्र 3a) एकच चुंबक आणि 30-डिग्री अभिमुखता असलेले कॉन्फिगरेशन निवडले गेले.
जेव्हा मानवीयरित्या बलिदान दिल्यानंतर प्राण्यांची अनेक वेळा प्रतिमा काढण्यात आली, तेव्हा ऊतींच्या हालचालीमध्ये हस्तक्षेप नसल्याचा अर्थ असा होतो की चुंबकाच्या अनुवादित गतीनुसार स्पष्ट आंतरकार्टिलागिनस क्षेत्रामध्ये सूक्ष्म, लहान कण रेषा ओळखल्या जाऊ शकतात.MP6 कणांची उपस्थिती आणि हालचाल स्पष्टपणे पहा.
LV-LacZ चे टायटर 1.8 x 108 IU/mL होते आणि CombiMag MP (MP6) मध्ये 1:1 मिसळल्यानंतर, LV वाहनाच्या 9 x 107 IU/ml च्या श्वासनलिका डोसच्या 50 μl सह प्राण्यांना इंजेक्शन दिले गेले (म्हणजे 4.5). x 106 TU/उंदीर).)).या अभ्यासांमध्ये, प्रसूतीदरम्यान चुंबकाला हलवण्याऐवजी, आम्ही चुंबक एका स्थितीत निश्चित केले की एलव्ही ट्रान्सडक्शन (अ) चुंबकीय क्षेत्राच्या अनुपस्थितीत व्हेक्टर वितरणाच्या तुलनेत सुधारले जाऊ शकते आणि (ब) वायुमार्ग शक्य असल्यास लक्ष केंद्रित करा.अप्पर रेस्पीरेटरी ट्रॅक्टच्या चुंबकीय टार्गेट भागात पेशी ट्रान्सड्यूस केल्या जातात.
मॅग्नेटची उपस्थिती आणि LV व्हेक्टरच्या संयोजनात कॉम्बीमॅगचा वापर प्राण्यांच्या आरोग्यावर विपरित परिणाम करत असल्याचे दिसून आले नाही, जसे की आमच्या मानक LV व्हेक्टर वितरण प्रोटोकॉलने केले.यांत्रिक गडबडीच्या अधीन असलेल्या श्वासनलिका क्षेत्राच्या समोरील प्रतिमा (पूरक चित्र 1) दर्शविते की एलव्ही-एमपी उपचार केलेल्या गटामध्ये चुंबकाच्या उपस्थितीत (चित्र 9a) लक्षणीय उच्च पातळीचे ट्रान्सडक्शन होते.नियंत्रण गटात (आकृती 9b) फक्त थोड्या प्रमाणात निळा LacZ डाग उपस्थित होता.एक्स-गॅल-स्टेन्ड सामान्यीकृत क्षेत्रांचे प्रमाणीकरण असे दर्शविते की चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत एलव्ही-एमपीच्या प्रशासनामुळे अंदाजे 6-पट सुधारणा झाली (चित्र 9c).
LV-MP (a) चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत आणि (b) चुंबकाच्या अनुपस्थितीत श्वासनलिका ट्रान्सडक्शन दर्शविणाऱ्या संमिश्र प्रतिमांचे उदाहरण.(c) चुंबकाच्या वापराने श्वासनलिकामधील LacZ ट्रान्सडक्शनच्या सामान्यीकृत क्षेत्रामध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या लक्षणीय सुधारणा (*p = 0.029, t-चाचणी, n = 3 प्रति गट, सरासरी ± मानक त्रुटी).
तटस्थ जलद लाल-दाग असलेले विभाग (पूरक आकृती 2 मध्ये दर्शविलेले उदाहरण) सूचित करतात की LacZ-दागलेल्या पेशी समान नमुन्यात आणि पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणे त्याच ठिकाणी उपस्थित होत्या.
वायुमार्ग जनुक थेरपीमधील प्रमुख आव्हान म्हणजे स्वारस्य असलेल्या क्षेत्रांमध्ये वाहक कणांचे अचूक स्थानिकीकरण आणि वायुप्रवाह आणि सक्रिय श्लेष्मा क्लिअरन्सच्या उपस्थितीत मोबाइल फुफ्फुसातील उच्च स्तरावरील ट्रान्सडक्शन कार्यक्षमता प्राप्त करणे.सिस्टिक फायब्रोसिसमधील श्वसन रोगांवर उपचार करण्याच्या उद्देशाने असलेल्या LV वाहकांसाठी, प्रवाहकीय वायुमार्गात वाहक कणांचा निवास वेळ वाढवणे हे आतापर्यंत एक अप्राप्य ध्येय आहे.Castellani et al. यांनी सांगितल्याप्रमाणे, चुंबकीय क्षेत्राचा वापर ट्रान्सडक्शन वाढविण्यासाठी इतर जनुक वितरण पद्धतींपेक्षा फायदे आहेत जसे की इलेक्ट्रोपोरेशन कारण ते साधेपणा, अर्थव्यवस्था, स्थानिक वितरण, वाढलेली कार्यक्षमता आणि कमी उष्मायन वेळ एकत्र करू शकते.आणि शक्यतो वाहन10 चा कमी डोस.तथापि, विवोमध्ये बाह्य चुंबकीय शक्तींच्या प्रभावाखाली वायुमार्गात चुंबकीय कणांचे संचय आणि वर्तन यांचे वर्णन कधीही केले गेले नाही आणि खरेतर अखंड जिवंत वायुमार्गामध्ये जनुक अभिव्यक्ती पातळी वाढविण्याची या पद्धतीची क्षमता व्हिव्होमध्ये दर्शविली गेली नाही.
PCXI सिंक्रोट्रॉनवरील आमच्या इन विट्रो प्रयोगांमध्ये असे दिसून आले की, MP पॉलीस्टीरिनचा अपवाद वगळता आम्ही तपासलेले सर्व कण आम्ही वापरलेल्या इमेजिंग सेटअपमध्ये दिसत होते.चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत, चुंबकीय क्षेत्र स्ट्रिंग बनवतात, ज्याची लांबी कणांच्या प्रकाराशी आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या सामर्थ्याशी संबंधित असते (म्हणजेच चुंबकाची निकटता आणि हालचाल).आकृती 10 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, प्रत्येक स्वतंत्र कण चुंबकीय बनतो आणि त्याचे स्वतःचे स्थानिक चुंबकीय क्षेत्र प्रेरित करतो तेव्हा आम्ही पाहतो त्या तार तयार होतात.या विभक्त फील्डमुळे इतर समान कण एकत्रित होतात आणि समूह स्ट्रिंग हालचालींशी जोडतात आणि इतर कणांच्या स्थानिक शक्तींच्या आकर्षण आणि तिरस्करणीय शक्तींमुळे.
(a, b) द्रवाने भरलेल्या केशिका आणि (c, d) हवेने भरलेल्या श्वासनलिकेमध्ये कणांच्या साखळ्या तयार होत असल्याचे दाखवणारे आकृती.लक्षात घ्या की केशिका आणि श्वासनलिका स्केलवर काढल्या जात नाहीत.पॅनेल (a) मध्ये MF चे वर्णन देखील समाविष्ट आहे ज्यामध्ये Fe3O4 कण आहेत.
जेव्हा चुंबक केशिका वर सरकला, तेव्हा कण स्ट्रिंगचा कोन MP3-5 साठी Fe3O4 असलेल्या गंभीर थ्रेशोल्डवर पोहोचला, त्यानंतर कण स्ट्रिंग त्याच्या मूळ स्थितीत राहिली नाही, परंतु पृष्ठभागावर नवीन स्थितीत हलवली.चुंबकहा प्रभाव संभवतो कारण काचेच्या केशिकाची पृष्ठभाग ही हालचाल होऊ देण्यासाठी पुरेशी गुळगुळीत असते.विशेष म्हणजे, MP6 (CombiMag) अशा प्रकारे वागले नाही, कदाचित कण लहान असल्यामुळे, वेगळे कोटिंग किंवा पृष्ठभाग चार्ज होते किंवा मालकी वाहक द्रवपदार्थ त्यांच्या हलविण्याच्या क्षमतेवर परिणाम करतात.CombiMag कण प्रतिमेतील कॉन्ट्रास्ट देखील कमकुवत आहे, हे सूचित करते की द्रव आणि कणांमध्ये समान घनता असू शकते आणि त्यामुळे ते सहजपणे एकमेकांकडे जाऊ शकत नाहीत.चुंबक खूप वेगाने फिरला तर कण देखील अडकू शकतात, हे दर्शविते की चुंबकीय क्षेत्राची ताकद नेहमी द्रवपदार्थातील कणांमधील घर्षणावर मात करू शकत नाही, असे सूचित करते की चुंबकीय क्षेत्राची ताकद आणि चुंबक आणि लक्ष्य क्षेत्र यांच्यातील अंतर एक म्हणून येऊ नये. आश्चर्यमहत्वाचेहे परिणाम हे देखील सूचित करतात की जरी चुंबक लक्ष्य क्षेत्रातून वाहणारे अनेक सूक्ष्म कण कॅप्चर करू शकतात, परंतु श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागावर कॉम्बिमॅग कण हलविण्यासाठी चुंबकावर अवलंबून राहण्याची शक्यता नाही.अशा प्रकारे, आम्ही असा निष्कर्ष काढला की vivo LV MF अभ्यासामध्ये वायुमार्गाच्या झाडाच्या विशिष्ट भागांना शारीरिकरित्या लक्ष्य करण्यासाठी स्थिर चुंबकीय क्षेत्रांचा वापर केला पाहिजे.
एकदा का कण शरीरात पोचले की, शरीराच्या गुंतागुंतीच्या हलणाऱ्या ऊतींच्या संदर्भात ते ओळखणे कठीण असते, परंतु एमपी स्ट्रिंग्सला “विगल” करण्यासाठी श्वासनलिकेवर चुंबक आडवे हलवून त्यांची शोधण्याची क्षमता सुधारली गेली आहे.रिअल-टाइम इमेजिंग शक्य असताना, प्राण्याला मानवतेने मारल्यानंतर कणांच्या हालचाली ओळखणे सोपे होते.जेव्हा चुंबक इमेजिंग क्षेत्रावर स्थित होते तेव्हा या स्थानावर एमपी सांद्रता सामान्यतः सर्वात जास्त असते, जरी काही कण सामान्यतः श्वासनलिका खाली आढळतात.विट्रो अभ्यासाच्या विपरीत, चुंबकाच्या हालचालीने कण श्वासनलिकेतून खाली ओढले जाऊ शकत नाहीत.हा शोध श्वासनलिकेच्या पृष्ठभागाला कव्हर करणारा श्लेष्मा सामान्यत: श्वासाद्वारे घेतलेल्या कणांवर प्रक्रिया करतो, त्यांना श्लेष्मामध्ये अडकवतो आणि नंतर म्यूको-सिलरी क्लिअरन्स यंत्रणेद्वारे ते कसे साफ करतो याच्याशी सुसंगत आहे.
आम्ही असे गृहित धरले की आकर्षणासाठी श्वासनलिकेच्या वर आणि खाली चुंबकांचा वापर केल्याने (चित्र 3b) एका बिंदूवर अत्यंत केंद्रित असलेल्या चुंबकीय क्षेत्राऐवजी अधिक एकसमान चुंबकीय क्षेत्र होऊ शकते, ज्यामुळे कणांचे अधिक समान वितरण होऊ शकते..तथापि, आमच्या प्राथमिक अभ्यासात या गृहितकाचे समर्थन करणारे स्पष्ट पुरावे सापडले नाहीत.त्याचप्रमाणे, चुंबकाची जोडी मागे टाकण्यासाठी सेट केल्याने (चित्र 3c) प्रतिमा क्षेत्रात अधिक कण स्थिरावले नाहीत.हे दोन निष्कर्ष असे दर्शवतात की दुहेरी-चुंबक सेटअप MP पॉइंटिंगच्या स्थानिक नियंत्रणात लक्षणीय सुधारणा करत नाही आणि परिणामी मजबूत चुंबकीय शक्तींना ट्यून करणे कठीण आहे, ज्यामुळे हा दृष्टीकोन कमी व्यावहारिक बनतो.त्याचप्रमाणे, चुंबकाला वरील आणि श्वासनलिका (आकृती 3d) च्या पलीकडे ओरिएंटिंग केल्याने देखील इमेज केलेल्या भागात शिल्लक असलेल्या कणांची संख्या वाढली नाही.यापैकी काही पर्यायी कॉन्फिगरेशन यशस्वी होऊ शकत नाहीत कारण त्यांचा परिणाम डिपॉझिशन झोनमधील चुंबकीय क्षेत्राची ताकद कमी होते.अशाप्रकारे, 30 अंशांवर सिंगल मॅग्नेट कॉन्फिगरेशन (Fig. 3a) ही विवो चाचणी पद्धतीमध्ये सर्वात सोपी आणि कार्यक्षम मानली जाते.
LV-MP अभ्यासात असे दिसून आले आहे की जेव्हा LV वेक्टर्स CombiMag सह एकत्रित केले गेले आणि चुंबकीय क्षेत्राच्या उपस्थितीत शारीरिकरित्या त्रास झाल्यानंतर वितरित केले गेले, तेव्हा नियंत्रणाच्या तुलनेत श्वासनलिकेमध्ये ट्रान्सडक्शन पातळी लक्षणीय वाढली.सिंक्रोट्रॉन इमेजिंग अभ्यास आणि LacZ परिणामांवर आधारित, चुंबकीय क्षेत्र LV ला श्वासनलिका मध्ये ठेवण्यास आणि फुफ्फुसात त्वरित खोलवर घुसलेल्या वेक्टर कणांची संख्या कमी करण्यास सक्षम असल्याचे दिसून आले.अशा लक्ष्यीकरण सुधारणांमुळे वितरित टायटर्स, नॉन-लक्षित ट्रान्सडक्शन, दाहक आणि रोगप्रतिकारक साइड इफेक्ट्स आणि जनुक हस्तांतरण खर्च कमी करताना उच्च कार्यक्षमता होऊ शकते.महत्त्वाचे म्हणजे, निर्मात्याच्या म्हणण्यानुसार, कॉम्बीमॅगचा वापर इतर विषाणू वाहक (जसे की AAV) आणि न्यूक्लिक ॲसिडसह इतर जनुक हस्तांतरण पद्धतींच्या संयोजनात केला जाऊ शकतो.